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在用TNFα治疗后，相较H1299/miRCont 细胞，H1299/miR-224 细胞 中poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)表达水平减少 Western blot analysis H1299/miR-224 and H1299/miRCont cells用及不用TNFα 处理 4 h Cell proliferation assay for H1299/miR-224 and H1299/miRCont cells 用及不用TNFα 处理 4 h. 在H1299细胞中， miR-224 明显减缓TNFα介导的生长抑制 miR-224通过以 肺癌中的TNFAIP1为靶点参与 TNFα介导的凋亡 稳定过表达miR-224的肺癌细胞中转染SMAD4 H1299 and H1573 肺癌细胞中均减弱了介导的增加增殖及迁移的能力 proliferation assay and migration assay of miR-224–overexpressing cells transfected with SMAD4 or empty vector Western blot analysis of miR-224 overexpressing cells transfected with SMAD4 (do not contain 3’UTR) or empty vector cell migration assay for miR-224 overexpressing cells transfected with SMAD4 or empty vector 用TGF-β处理miR-224过表达组及对照组细胞 在H460细胞中，miR-224 明显损害了 TGF-β介导的SMAD4细胞核转录作用 miR-224 明显减弱了TGF-β介导的对细胞生长及迁移能力的抑制作用 miR-224以SMAD4为靶点在TGF-β信号通路中起到重要作用 启动子低甲基化及激活的ERK信号通路介导miR-224的表达 技术路线 低甲基化探针 检测miR-224启动子甲基化水平 miR-224与启动子甲基化的关系 甲基化特异高分标率溶解分析 重硫酸盐序列 验证 TCGA数据库 相关分析 TCGA 数据库 检测ERK及miR-224表达是否相关 相关分析 细胞系 佛脂醇治疗 免疫荧光等检测 miR-224是否受ERK信号通路调控 miR-224, miR-452及GABRE的标准化表达值从TCGA 数据库中提取出并进行Pearson 相关分析 miRNA表达受表观遗传修饰及转录激活控制。 miR-224 and miR-452 位于宿主基因 γ-Aminobutyric Acid A Receptor (GABRE)内显子5上，并且GABRE启动子 区域有CpG 岛 图式结构 显示miR224~miR452~GABRE的基因位点。miR-224 and miR452 位于GABRE的6内显子. TSS i显示假定的转录位点。黑色区域显示CpG 岛延伸到GABRE的外显子1 正相关 这三个基因受相同的启动子调节 选择位于 CpG 岛位于启动子区域的9个甲基化探针, Pearson 相关分析 ADC (n = 221) SCC (n = 125) 8个探针均显示在NSCLC中与miR-224 表达的负相关 miR-224 and methylation probe cin (A) lung ADC and (B) SCC. 启动子甲基化在抑制miR-224转录中起重要作用 甲基化特异高分标率溶解分析 469NAT 489NAT A549 H647 469NAT 及485NAT 细胞10–30% 甲基化 ，两个肺癌细胞系中0% 甲基化 melting curves from each cell line --green standard melting curves --orange 重硫酸盐序列 469NAT 489NAT 证实了正常肺组织中每个CpG 甲基化水平 用脱甲基化试剂 5-aza-CdR处理 3 天 miR-224 表达水平增加 非小细胞肺癌中，miR-224启动子相关CpG岛的低甲基化水平的部分原因是由于肺癌中的miR-224 高表达。 前期研究 我们观察到一个趋势：相较野生型的肺癌细胞系，有RAS突变的肺癌细胞系中miR-224 的表达更高。 188例ADC 总ERK2蛋白与 miR-224表达水平之间存在显著正相关 用佛脂醇活化 ERK1/2 H460 A549 相较不使用佛化醇治疗的肺癌细胞系，使用佛脂醇的细胞系中miR-224的表达均