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第三章 植物外源DNA的导入方法 外源DNA的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源DNA片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。  目前已经建立了十多种外源DNA导入方法，按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法： 1、物理法：基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等； 2、化学法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸钙－DNA共沉淀、脂质体法等； 3、生物法：农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。  按照媒介类型的有或无，可分为载体介导法、直接导入法和种质系统介导法： 1、载体介导法：将目DNA转入农杆菌或病毒中，并以之为载体，随着它们对植物的感染而将目的DNA导入植物细胞中； 2、直接导入法：以裸露的外源DNA通过化学或物理方法直接导入植物细胞； 3、种质系统介导法：借助植物自身的种质细胞与媒介（如花粉、子房、花粉管通道、幼胚等）来实现外源DNA导入，它包括花粉管导入法、子房、幼穗、幼胚注射法、种子浸渍法等。 第一节?????? 农杆菌介导法 一、原理 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。从一种致癌的农杆菌中分离出了一种巨大质粒（约200Kb），称为致癌质粒，简称Ti质粒。Ti质粒上有一段DNA被称为转移DNA（简称T－DNA），能转移并整合到植物染色体上，其上携带的基因能在受体细胞中表达。Ti质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载体。这种利用农杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或DNA片段插入Ti质粒的T－DNA中，并随之导入受体植物细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。 l??????? Ti质粒的必需组成元件，包括T－DNA区域和致毒基因(Vir gene) Ti质粒为160～250 kb的大质粒，包括毒性区(Vir区)、结合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分，其中与冠瘿碱生成有关的是Vir区和T-DNA区。前者大小为30kb，分virA-J等至少10个操纵子，决定了T-DNA的加工和转移过程。 T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中，但这些基因本身与T-DNA的转移和整合无关，仅左右两端各25bp的同向重复序列为其加工所必需，其中14bp是完全保守的，分10和4bp不连续的两组，两边界中以右边界更为重要。 （1）T-DNA ?T-DNA区段的两端均有相似的25bp的特殊序列。 TL?? GGCAGGATATATTCAATTGTAAAT TR?? GGCAGGATATATCGAGGTGTAAAA  二、操作步骤 用农杆菌法转化受体植物的全过程包括： 植物受体系统的建立 Ti质粒转化载体系统的构建 工程农杆菌的制备 外源基因的转化 转化体的筛选和转基因植株的检测 第二节?????? 基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，是一种借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。  一、原理 基因枪技术的基本原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金（或钨）粉等金属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入细胞中的目的。 二、操作步骤 1、受体细胞或组织的预处理 通过渗透剂（甘露醇、山梨醇等）处理来调节受体细胞或组织的渗透压，维持细胞的高渗状态，使其在轰击受伤后细胞质的外渗减少，从而有利于细胞的成活。  2、DNA微弹的制备 这一过程是将外源基因DNA分子以一定比例附着在金属微粒子（金粉或钨粉）载体上。 3、受体材料的轰击  4、过渡培养与筛选培养 轰击后的材料先在不含选择压力的培养基中过渡培养一段时间（一般1～2周），以利于受轰击材料的恢复并充分表达外源基因（包括选择压力抗性基因），再转入有选择压力的培养基中进行培养，以抑制非转化细胞的生长，而转化细胞则能继续生长分化，从而被筛选出来。 第三节?????? 聚乙二醇法 一、基本原理 聚乙二醇（PEG）是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之间或使DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因此称之为PEG诱导法。  二、操作程序 1、分离原生质体 2、提取带有目的基因的质粒或其它外源DNA； 3、取0.5ml新制备的原生质体悬浮液（原生质体密度为2X106/ml）,加入50μl小牛胸腺DNA，混匀后静置10分钟