第一节工具酶限制性内切酶.pptVIP

一、工具酶 到 20 世纪 60 年代中期，人们已经认定限制和修饰是细菌遗传学领域中最重要和最有趣的现象（例子可见 Hayes，1968），但是谁会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响呢？ 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？ 寄主的限制与修饰有两方面的作用。一是保护自身的DNA不受限制，二是破坏外源 DNA, 使之迅速降解。根据限制-修饰现象发现的限制性核酸内切酶,现已成为重组DNA技术的重要工具。 限制和修饰现象 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。 经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly Smith，1970；Smith W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。 Ⅱ型限制内切酶的发现 突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。 嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。 在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等，1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。 Ⅰ型限制性内切酶 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研究中很有意义，但其不 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因而不具备实用性。? Ⅱ型限制性内切酶 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。 Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列； 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性， 最常见的 Ⅱ 型限制性内切酶 在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化酶多属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列； 但也有少量的酶与DNA 结合形成异二聚体，识别非对称序列（如BbvCI 识别 CCTCAGC）。 一些酶识别连续性序列（如 EcoRI 识别 GAATTC，其中的两个半识别序列是相连的）； 而另一些识别非连续性序列（如 BglI 识别CCNNNNNGGC，其中的两个半识别序列是不相连的）。 另一种比较常见的 Ⅱ 型限制性内切酶 所谓的ⅡS 型酶，如 FokI 和 AlwI，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。它们识别连续的非对称序列。 一般认为这些酶主要以单体的形式结合到 DNA 上，与邻近酶分子的切割功能域结合成二聚体，协同切开 DNA链。因此一些ⅡS 型酶在切割含有多个识别位点的 DNA 分子时活性更高。 Ⅲ 型限制性内切酶 也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割。 这类酶很少能达到完全切割。 某些识别和切割独特的酶 BsmBⅠ Ⅳ 型限制性内切酶 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。 限制性内切酶切割后产生一个 3 -羟基和一个 5 -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺苷