葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达及一步纯化.pdfVIP

第 9 卷第 5 期 过 程 工 程 学 报 Vol.9 No.5 2009 年 1 0 月 The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2009 葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达及一步纯化 1 2 周 进 ， 银 鹏 (1. 清华大学深圳研究生院生命学部，广东 深圳 518055 ；2. 南京林业大学理学院，江苏 南京 210037) 摘 要：从绿色木霉中克隆了葡萄糖苷酶 bg 基因，构建入表达载体 pPIC9k-His6 中，然后在AOX1 启动子的控制下， + 在毕赤酵母 GS115 菌株中表达. 在 5 L 发酵罐中发酵 120 h，重组P. pastoris Mut 菌株湿重达 360.6 g/L，葡萄糖苷酶 浓度和酶活分别为 2.1 mg/mL 和 73.5 U/mL. 经亲和层析一步纯化后，得到了电泳纯的葡萄糖苷酶. HPLC 分析显示其 纯度为 95.6%，比酶活为 71.9 U/mg. 纯化过程酶得率为 73.6%，纯化倍数为 42.6. 纯酶的等电点为 5.0，最适温度为 + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ + 50 ℃，最适pH 为 6.5. 金属离子 Ag , Ca , Cu , Fe 及 SDS 对葡萄糖苷酶活性有抑制作用，而 Mg , Mn , K 能增强 2+ 能使酶活提高 20%. 葡萄糖苷酶活性，其中 1 mol/L Mg 关键词：葡萄糖苷酶；绿色木霉；毕赤酵母；表达；一步纯化 中图分类号：Q814.1 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2009)05−0981−06 使纤维素酶系中某一组分的比例提高，取得了一定的效 1 前 言 果. 但以往的研究主要集中在内切酶、外切酶上，这些 近年来可再生能源的研发成为各国竞逐的热点，利 酶在洗涤和造纸行业中起关键作用[5−8]. 而对于在生物 用生物学方法获得新能源的研究也变得异常活跃. 其 质能源开发中起重要作用的葡萄糖苷酶，近年来才逐渐 中，以纤维素为原料生产的燃料乙醇作为一种非常有潜 引起人们的重视. Geysens 等[9]克隆了里氏木酶的葡萄糖 力的洁净能源，正日益成为人们关注的焦点[1]. 纤维素 苷酶基因并进行了表达，粗酶液的酶活为 0.46 U/mL ； 乙醇工艺首先是生物质水解产生还原糖，然后利用还原 Murray 等[10] 曾将木霉中葡萄糖苷酶在酿酒酵母中异源 糖发酵产生乙醇，前一步是影响生产成本的关键，即酶 表达，证实了酶的最适温度和 pH 值分别为 45 ℃和 6.0. 解纤维素生成还原糖，主要通过纤维素酶系水解纤维素 国内目前对葡萄糖苷酶的研究主要集中在菌种选育和 实现 [2]. 具体过程是，首先利用葡聚糖内切酶 酶学性质改良上，虽然有报道[11]将葡萄糖苷酶成功构建 (Endo-glucanase, EC ) 和 葡 聚 糖 外 切 酶 重组质粒并在大肠杆菌中得以表达，但分离纯化步骤较 (Exo-g