分子生物学chapter5研究法new.ppt

分子生物学 第五讲 分子生物学基本研究法 基因文库 基因组文库 基因组文库 质粒文库和噬菌体文库 基因组文库 不同载体中基因组文库的大小 cDNA 文库 mRNA的纯化 cDNA 合成 cDNA末端的处理 基因组文库和cDNA文库的比较 文库筛选 核酸杂交法 PCR筛选法 免疫筛选法（表达文库筛选） 5、pGEM-3Z质粒 长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 含有两个噬菌体启动子（T7和SP6），为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。 6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。 5. 3. 3 λ噬菌体载体 噬菌体可在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。 分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。 在溶菌周期，噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。 溶源生长周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫作温和噬菌体。 λ噬菌体的分子量为48.5kb，是温和噬菌体。 λ噬菌体有61个基因，其中约一半参与了生命周期的调控，是λ噬菌体的必需基因；另一部分基因则被称为非必需基因，被外源基因取代后不影响生命周期。 在λ噬菌体线性DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的完全互补的5‘突出序列（即粘性末端），注入到寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子，并进一步超盘绕。这种粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（cohesive-end site）。 图5-23 λ噬菌体线性DNA分子的粘性末端及其环化作用。(a) 具有互补单链末端（粘性末端）的λDNA分子，(b) 通过粘性末端之间的碱基配对作用实现的线性分子的环化作用，由此形成的双链区叫作cos位点。 5. 3. 5 pBluescript噬菌粒载体 pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。 (i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动； (ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA； (iii)编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记； (iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。 ● 基因组文库 ● cDNA文库 步骤: 1) 分离基因组 DNA 2) DNA 的断裂 物理剪切 (包括吹吸、振荡和超声波）和限制性酶解 3) DNA 片断的分离与连接 4) 包装，转染或者转化 EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I Complete digestion High enzyme concentration Incomplete digestion Low enzyme concentration 部分酶解或完全酶解 EcoR I Partial digestion Infect cells Genomics Genome cut up with restriction enzyme Recombinantplasmid OR Recombinantphage DNA Bacterialclone Phage clone Phage library Plasmid library 1000 酵母人工染色体 (YAC） 300 细菌人工染色体(BAC) 100 P1噬菌体* 45 粘粒(柯斯质粒cosmid ） 25 噬菌体 20 质粒 插入片断 (kb) 载体类型 ln (1 - P) ln (1 –