分子生物学第二章dna结构.pptVIP

第二章 DNA的结构 第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 DNA的物理化学性质 第五节 超螺旋和拓扑异构 第一节 遗传物质的本质 4.DNA为遗传物质的证据 1952年Hershey和Chase等，T2噬菌体，35S和32P标记 第二节 核酸的化学组成 酮式烯醇式互变异构 胺式亚胺式互变异构 第二节 DNA的二级结构 第四节 DNA的物理、化学性质 第五节 超螺旋和拓扑异构 pH ~ 12 酮基 → 烯醇基 pH ~ 2-3 NH2 → NH2+ (质子化) 改变氢键的形成与结合力 （7） 极端pH条件的影响 一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低 常用的变性方法 ☆ 热变性 ☆ 碱变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 pH11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 ◎ 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L D.S DNA S.S DNA Denaturation ▲ ▼ Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ) 二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation） 概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火） 1、 影响DNA复性过程的因素 ： ? 阳离子浓度 0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除DNA链间的静电斥力 复性反应的温度 低于Tm值 25℃左右 (60-65℃) ? S.S, DNA 的初始浓度 C0 ? DNA 分子中, DNA链的排列状况 (随机排列, 重复排列) ? S.S. DNA分子的长度（片段的大小） S.S. DNA愈长 S.S. DNA愈短 → 分子扩散愈慢 → 复性愈慢 → 分子扩散愈快 → 复性愈快 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 三、C0t曲线－－复性发生过程的讨论 ? 遵循二级反应动力学 dCt / dt= -KC02 反应初始 t = 0 ? 单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ） 单链 DNA浓度 = C0 反应达 t 时 单链DNA浓度 = Ct K＝复性速度常数 dCt / dt= -KC02 积分 Ct / C0 = 1 / (1+KC0t ) 当 Ct / C0 = 1/2 时 Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2)) K = 1 / Cot(1/2) Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常数 Ct/C0是C0t的函数 按此公式作图得C0t曲线 C0t(1/2)值对DNA具有特征性，其中与DNA的碱基对数目成反相关; 在控制反应条件相同的前提下, 两种DNA分子的C0t(1/2)值, 取决于基因组DNA的排列复杂性 ( 复性动力学的复杂性, Kinetic complexity, K.C X ) K.C=基因组复杂性=单一序列+单位重复序列 人工合成 AAAAAAAA K. C. = 1 C0t(1/2) = 2×10-6 Ct/C0 0 1 0 1 C0t(1/2) C0t(1/2) Fraction reassociated(1-Ct/Co