分子生物学第四章rna的转录.pptVIP

RNA转录RNA transcription Chapter 4 4.1 RNA合成的基本特征 以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物； 碱基为：A、U、C、G 以DNA为模板； 按5′-3′方向合成； 在体内DNA双链中仅一条链作为模板; RNA的序列和模板是互补的; 转录时DNA-RNA杂合双链分子是不稳定的，RNA链很快被游离的DNA所取代，DNA又恢复双链状态。 4.2 RNA合成的酶学 聚合的过程中不需要引物； 需要双链的DNA作为起始的模板； Mg2+对RNA聚合酶的活力是必需的； 所有的RNA聚合酶没有3’-5’的外切活性，具有10-5-10-4左右的出错率； 通常是多亚基结构，但也有单亚基的情况，例如噬菌体T3、T7的RNA聚合酶是单肽，而且移动速度为200 nt/sec。 4.2.1 E. coli RNA聚合酶 a 亚基 由rpoA基因编码； 在全酶中有两个等同的亚基； 功能不是太清晰； 但如果该酶发生了突变，全酶与启动子的亲和力会降低； 另有学者报道，与链的延伸相关。 β 亚基 由rpoB基因编码； RNA合成的催化中心； 利福平（ Rifampicin ）能结合该亚基，从而抑制RNA转录， rpoB基因的突变能产生利福平的抗性； β 亚基也许包含两个domain，分别负责RNA转录的起始和延伸。 β’ 亚基 由rpoC基因编码； 与两个Zn 2+结合； 肝素（ Heparin ）能结合β’ 亚基，从而抑制转录； 由于肝素是与DNA竞争来与RNA聚合酶结合，所以β’ 亚基的功能也许与模板DNA的结合相关。 σ 亚基 由rpoD基因编码；大肠杆菌编码几个σ因子，此处的σ因子称为σ70； 决定RNA聚合酶在启动子区域正确起始，如果没有σ因子，RNA的转录将可以在任一DNA模板区域起始； 当正确起始，RNA链延伸到8-9nt时， σ因子脱落。 4.2.2 真核 RNA聚合酶 包含三种RNA聚合酶 RNA Pol Ⅰ 存在核仁中，转录r RNA （5.8S、18S、28S）; RNA Pol Ⅱ 存在核质中，转录m RNA与sn RNA （核内小RNA）; RNA Pol Ⅲ 存在核质中，转录t RNA与5S RNA。 三种RNA聚合酶的大小均在500KDa，包含两个大亚基和4-8个小亚基。 4.3 原核生物的启动子结构 把开始转录的第一个碱基定义为+1，因此启动子区域为负数标志； 启动子区域一般包括40-60bp; -55 to +20：与RNA聚合酶结合； -20 to +20：与RNA聚合酶紧密结合，可以避免DNAase Ⅰ的消化； +1 to -40：对启动子的功能是非常关键的； -10 -35区域：是非常关键的启动子区域。 4.3.1 -10区 (Pribonow box) 长度6 bp，分布在位置-10的两侧； 保守序列为：TATAAT，TATPuAT更加合适； 前两个碱基和最后一个碱基在大肠杆菌所有的基因中都是极其保守的：T80A95T45A60A50T96; 这个六聚体距离+1大概5-8bp，这个距离对于启动子的活性是非常关键的。 4.3.2 -35区 (Sextama box) 在 –35位置附近的一个保守的六聚体； 保守序列为 T82T84G78A65C54A45， 在大肠杆菌所有的启动子中，前三个碱基(TTG)是非常保守的； 在90%的启动子中，-35区与-10区的距离一般保持在16-18bp之间。 大肠杆菌中不同基因启动子序列比较 -10区与-35区控制转录强度 在σ因子的辅助下，RNA聚合酶首先与-35区结合，由于RNA聚合酶能覆盖60-70个bp的DNA序列，因此酶分子的某个区域能到达-10区域，并随即与其结合； 三种因素控制启动子的强度： -35区与RNA聚合酶的亲和性； -10区的碱基可以影响开放启动子复合物的形成速率； -10区与-35区之间的距离决定了启动子的效率，17bp是最佳间距。 4.3.3 CAP位点 当体系中同时存在葡萄糖和乳糖的时候，大肠杆菌对乳糖是不理睬的，这是为什么呢？ 当细胞缺少葡萄糖时，腺苷酸环化酶将ATP环化为cAMP，后者与其受体蛋白CAP结合，这个复合物再与启动子上的CAP位点结合，只有这样，乳糖启动子才能与RNA聚合酶结合，起始转录。当有葡萄糖存在时， cAMP无法形成…… 乳糖操纵子存在两个CAP位点 -70 to -50：具有一个反向重复序列 -50 to -40：位点1的结合促进了位点2的结合 乳糖操纵子的-10区碱基序列为TATGTT，由于中心存在G:C碱基对。使得RNA聚合酶无法解开双链进行转录起始； CAP-cAMP复合物的结合，使得CAP2附近的G:C稳定性降低，使得RNA聚合酶能顺利解开DNA双链，起始转录； 如果把-1