分子生物学研究方法下核酸分子杂交技术.pptVIP

分子生物学研究方法—— 核酸分子杂交 第一节 概述 一、核酸分子杂交的概念： 用已知的DNA或RNA片段来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补原则发生同源性结合，再经过显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。 具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 二、核酸分子杂交的基本原理 （一）DNA的变性 1. DNA的变性的概念DNA分子由稳定的双螺旋结构松解 在某些理化因素作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双股螺旋或发夹结构打开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸变性。 DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。 2.引起DNA的变性的因素： （1）热变性：90-100℃，最常用 （2）酸碱变性：常采用碱变性 （3）化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的 化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变 3.变性DNA的性质 溶液粘度降低 溶液旋光性发生改变 增色效应或高色效应 变性DNA的性质（之一） 　　 （1）溶液粘度降低 DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软” 而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。 变性DNA的性质（之二） 　　 （2）溶液旋光性发生改变 变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构型发生改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。 变性DNA的性质（之三） （3）增色效应或高色效应（ hyperchromic effect ） DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。 增色效应（一） DNA分子在250－280nm 波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。 紫外吸收的结构基础是：DNA分子中碱基间电子的相互作用；双螺旋结构中，有序堆积的碱基“束缚”了这种作用。 DNA变性后，双链解开，碱基间电子的相互作用更有利于紫外吸收， 故而产生了增色效应。 增色效应（二） 增色效应可以作为DNA变性的指标 不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20－30%之间。 4.变性温度 （1）熔解温度（ melting temperature，Tm） 热变性使DNA分子双链解开50%所需温度；或A260值达到最大值1/2时的温度，称为熔解温度。 增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变性温度取决于DNA自身的性质。 变性温度 （2）特点： 爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度。 狭窄性：变性温度范围很小。 变性温度（三） （2）影响变性温度的因素： 不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身下列两方面的性质所造成的： 1）DNA的均一性； 2）DNA的（G+C）含量。 1）DNA的均一性 有二种含义 A.DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天然 DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢链断裂几乎可“齐同”进行； B.待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其Tm 值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。 2）DNA的（G+C）含量 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量。 （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm值越高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量，故（G+C）含量高的DNA，其变性Tm也高。 Tm与（G+C）含量的关系 Tm 与DNA中（G+C）含量存在着密切相关性。 Tm与（G+C）含量（X）百分数的这种关系可用以下经验公式表示（DNA溶于0.2mol/L NaCl中）:X%（G+C）=2.44（Tm-69.3） 核苷酸?20 Tm=4（G+C）+2（A+T） 5.DNA变性曲线（一） 以温度对DNA溶液的紫外吸光度作图，得到的典型DNA变性曲线呈S型。 S型曲线下方平坦段，表示DNA的氢键未被破坏，待加热到某一温度处时，次级键突发断开，DNA迅速解链，同时伴随吸光度急剧上升，此后因“无链可解”而出现温度效应丧失的上方平坦段。 DNA变性曲线