第9章聚合酶链反应技术及应用.pptVIP

* * * * 。 * * * * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 荧光信号如何产生？ 如何对初始模板定量? Real time PCR 实时监测系统 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 线性基线期：扩增最初的10～15个循环，此时，PCR反应处于起始阶段，扩增产物很少，产生的荧光信号很低； 指数期初期：进入指数期初期，荧光强度达到一个阈值,为基线荧光信号均值标准差的10倍。 指数期：PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每循环一次，产物倍比增加。 平台期：此时荧光信号不再随扩增循环数的增加而增加。 PCR扩增的4个主要阶段 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * Ct值: 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。 Ct值的概念 Threshold line C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 阈值线 Ct值 Ct值 如何对初始模板定量？ * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 荧光定量PCR原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 XCt=X0 (1+Ex)Ct =N log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数 最后结论：Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 标准曲线（使用外参照物的定量PCR） 将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real time PCR，就会按照起始DNA浓度由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模版的对数值之间存在的线性关系，就可制作标准曲线。未知浓度的样品与标品一样，也可得到Ct值，并将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模版量。 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 荧光信号如何产生？ 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * SYBR Green I SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光（ SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位） 变性时，DNA双链分开，无荧光 在延伸结束阶段采集荧光信号。 SYBR Green 也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission 双链荧光染料 SYBR-Green I荧光染料原理示意图 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * Real-Time PCR，SYBR green Cycle 1 Cycle 3 Cycle 2 Molecular Probe公司的一个专利产品， US Patent 5,436,134 1993年7月12日申请 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 荧光强度的变化是由于 温度不断升高 双链DNA解离，SGI游离 Tm是熔解曲线的特征值： SYBR Green I 熔解曲线分析 当双链DNA解链一半时，