第七章基因的重组与转移.pptVIP

?-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 一、原理： 三 根据插入基因的表型选择 1.弥补缺陷 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的培养基中生长 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。 DHFR 载体 连接 转化受体菌 三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板 含DHFR的克隆才能生长 例： 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 2. 增加新性状 4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 5’ 3’ 载体 插入片断 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 五、载体和外源DNA插入片段的连接结果 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 1. 目的 增加受体菌细胞膜的通透性。 7.2 基因转移 一、感受态大肠杆菌的制备 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。 2. 菌种 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 3. 制备原理 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 4. 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 冰冷的0.1 mM CaCl2重悬 4℃离心 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 冰冷的0.1mM CaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的0.1mM CaCl2重悬 大肠杆菌感受态细胞的制备： 单菌落接种于培养基，培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体，冰浴10 min。 用10 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体 用1 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长） 2. 转化率 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 3. 转化方法 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA （1）热休克法 4. 平板培养基培养细菌 10-100?L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。 ①环形质粒数 （1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 ①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ③CaCl2处理 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 （2）感受态细胞 （competent cells) 把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。