第七章克隆基因的表达----2007植物基因工程.ppt

Plant Biotechnology Traditional crossbreeding 3 植物基因转化受体系统的类型及其特性 植物基因转化受体系统的条件： 高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 对选择抗生素敏感 对农杆菌侵染有敏感性 特点： （1）外植体细胞经历脱分化和再分化两个过程 （2）扩繁量大 （3）外植体试材广泛 （4）该再生系统获得的再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差。 （5）该再生系统几乎适用于每一种通过离体培养途径能再生植株的植物。 （6）嵌合体多 3.2 、直接分化再生系统 所谓直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。 用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体。 特点： （1）获得再生植株的周期短，操作简单。 （2）体细胞无性系变异小。 （3）较多的嵌合体 （4）转化频率低于愈伤组织再生系统 3.3、 原生质体再生系统 特点： （1）原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核。 （2）通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆，嵌合体少。 （3）原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定。 （4）原生质体培养用期长、难度大，再生频率低 （5）遗传变异大，遗传传稳定性更差。 3.4 、胚状体再生系统 植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生过程。 经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构，称之为体细胞胚或胚状体。 特点 （1）胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，这些胚性细胞具有很强的接收外源DNA的能力转化率和转化效率均高。 （2）多数单细胞起源，嵌合体少。 （3）胚状体具有两极性，即在发育过程中同时可分化出芽和根形成完整植株，这样减少了不定芽发育途径中比较困难的一个环节——生根培养。 （4）利用转基因的胚状体可以生产人工种子。 （5）体细胞胚成苗快、数量大有利于生产和推广。 3.5 、生殖细胞受体系统 利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也称之为种质系统。 两个途径利用生殖细胞进行基因转化： 一利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，进一步分化发育成单倍体植株，以此为受体进行转化。 二、直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。 特点 （1）有更强的接收外源DNA的能力。 （2）能使转基因充分表达，而且通过加倍后即可成为纯合二倍体，加速纯化过程。 （3）利用植物自身的授粉过程操作方便。 （4）利用该受体系统进行转化受到季节的限制。无性繁殖的植物不宜采用。 形态结构 农杆菌细胞呈杆形，0.8x1.5~3.0μm 以1~4根周生鞭毛运动 菌落无色，随菌龄增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多菌株生成的菌落呈粗糙型。 寄主范围 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，根据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。一般认为单子叶植物无敏感性，但近年也有侵染的报道。 农杆菌的Ti质粒 1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。 1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。 根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化 根癌农杆菌转化程序 工程菌的保存 目的：创造一个适合细菌休眠的环境（低温、干燥、缺氧），使其得以长期保存。尽量减少菌株的传代次数；使菌种经保存后不死亡、不污染杂菌，并保持其原有性状，降低菌种的变异率，目的基因不丢失。 外植体的选择 Mayer等指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，可能只有处于细胞分裂周期的S期才具有外源基因的转化能力，因为核基因组DNA正在复制时才能使外源DNA整合。因此细胞具有分裂能力是转化的基本条件。 外植体的选择原则 ①以叶片、子叶、胚轴为首选外植体材料。 ②选择幼年的外植体。 ③以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外植体时应考虑其转化的最佳感受期。 ④基因转化外植体和组织培养外植体的选择基本一致，因此可参照该植物组织培养外植体的使用进行选