组胺H3受体激活剂高通量筛选细胞模型的研究-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（９）：６１～６７ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 技术与方法殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 组胺Ｈ３受体激活剂高通量筛选细胞 模型的研究 １，２ ３ １，２ １，２ １，２ 曹　婧 　张　烨 　彭志刚 　李际仙 　王少鹏 （１中国科学院北京基因组研究所　北京　１０１３００　２中国科学院研究生院　北京　１０００３９） （３上海华大天源生物科技有限公司　上海　２０１２０３） 摘要　目的：建立基于报告基因的组胺Ｈ３受体（Ｈ３Ｒ）激活剂的高通量筛选模型，用此模型对收 集到的中草药化合物组分进行筛选，以发现新的组胺Ｈ３Ｒ激活剂。方法将Ｈ３Ｒ基因质粒（Ｈ３Ｒ／ ｐＣＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ）与报告基因质粒（３ＸＣＲＥＬＵＣ）按３∶１的比例共转染入ＨＥＫ２９３细胞，建立了稳 定的Ｈ３Ｒ配体的报告基因筛选细胞株。激活剂与细胞表面Ｈ３Ｒ结合后，激活相应的信号通路， 调节Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ刺激后的报告基因的表达，通过测定荧光素酶报告基因表达水平的变化，评估激活 剂影响Ｈ３受体的生物活性。结果 通过对筛选条件，如激活剂孵育时间、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ终浓度、化合物 溶剂的选择、溶剂ＤＭＳＯ终浓度等的优化，建立了可靠的筛选方法。该模型的Ｚ因子可达到０５ 以上，稳定性可保持２０代，完全符合高通量筛选需求。利用该细胞模型对多种中草药萃取物进行 了筛选，找到了两种对Ｈ３Ｒ有活性的中药组分。结论 建立的细胞模型可以有效的应用于以组胺 Ｈ３受体为靶点的高通量药物筛选。 关键词　组胺Ｈ３受体（Ｈ３Ｒ）　报告基因Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ　高通量筛选 中图分类号　Ｒ９６５．１ ［７］ 　　随着组合化学、微芯片技术和基因组学的发展，高 胃肠溃疡的药物 。随着人类基因组计划的完成，组 通量筛选技术（ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ＨＴＳ）应运而 胺受体家族两个新成员 Ｈ３和Ｈ４受体分别于１９９９年 ［１］ ［８］ 生 。ＨＴＳ就是利用药靶的分子或细胞水平的生物学 和２００１年被发现 。他们所偶联的Ｇ蛋白都是 Ｇｉ。 机制，以微孔板为基础，进行大量筛选，找到能选择性 Ｈ３受体集中表达在神经元细胞中；Ｈ４受体主要表达 ［２］ 于造血细胞系中。Ｈ３受体一开始是作为一种突触前 地作用于药靶的有生物活性的化合物 。 　　组胺受体是高通量筛选中重要的药靶。Ｈ１和Ｈ２ 自身受体而存在的，负责调控包括组胺在内多种神经 ［３，４］ 传导递质的释放。后来人们通过基因敲除小鼠等研究 受体发现和研究的较早 ，它们与后来发现的组胺受 体家族成员一样，属于Ｇ蛋白偶联受体家族（ＧＰＣＲｓ）， 手段，发现 Ｈ３受体还参与调控包括睡眠、觉醒、心功 ［５，６］ ［９］ 分别偶联 Ｇｓ和Ｇｑ两种 Ｇ蛋白 。组胺通过 Ｈ１受 能、胃酸分泌、记忆以及认知在内的多种生理过程 。 体引起各种过敏反应的发生。因此， 对于与其特异性作用化合物（激动剂或拮抗剂）的开 Ｈ１受体的一些拮 ［１０］ 抗剂一直作为主要的抗过敏的药物销售。而 Ｈ２受体 发，成为了世界各大制药企业研发的新热