血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析前言血小板活化-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.8.8.175 血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析 前言 血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用 流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板 的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小 板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。 使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是： 检测血小板的反应性。 了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血 小板外。 同时检测多种血小板表面标志。 高度灵敏。 直接检测血小板的多种标志。 使用全血，标本量少。 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。 BDIS 血小板活化试剂组成为： PAC-1 FITC ：早期血小板活化的标志物，即活化的 gp Ⅱb/Ⅲa 复合物，抗体与活 化后血小板膜表面的 gp Ⅱb/Ⅲa 复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS 抗体 为 IgM 型，建议使用 PAC-1 结合阻断剂 RGDS 做阴性对照。 CD62P PE ：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板 胞浆内 a 颗粒含有 CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板 表面表达 CD62P 。 CD61 PerCP ：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血 小板结合。CD61 与 CD41 联合，即为血小板表面 gp Ⅱb/Ⅲa 复合物。在本试验 中，用FL3 设阈值。 试验用品 采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管。 一次性 12×75 mm Falcon 试管。 微量加样器和加样头。 中国试剂网 3.8.8.175 BD 抗体：2-8 ℃保存。 荧光抗体 FITC PE PerCP 对照管 PAC-1+RGDS IgG1 CD61 试验管 PAC-1 CD62P CD61 RGDS (PAC-1 阻断剂) ：用PBS 配制，10mg/ml。 血小板激活剂：ADP ，浓度 2 ′10-4M，2-8 ℃保存。也可选用其他激活剂，如 PMA 、纤维蛋白、TRAP 。 PBS 缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8 ℃保存。 固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 缓冲液，2-8 ℃可保存一周。 振荡混匀器。 FACS 流式细胞仪：进行数据获取。 CaliBRITE Beads/FACSComp 软件：FACS 仪器校正，预设获取条件。 CellQuest 软件：试验数据获取和分析软件。 操作步骤 1. 标本采集： (1)采血管顺序编号。 (2)抽取静脉血，采血管中注入2ml 。 (3)于 10 分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。 2. 血小板激活： (1)试管内加入 50mlADP，450ml 全血，轻轻摇匀。 (2)室温孵育 5 分钟。 (3)立即染色。 3. 荧光抗体染色： (1)Falcon 管编号。 (2)在对照管中加入 PE 同型对照、CD61 PerCP、PAC-1 各 20ml ，RGDS 加 10ml。