基因芯片的必备知识和操作流程.docxVIP

基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。 ?? 基因芯片技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。 1.基本原理和技术基础 基因芯片以DNA杂交为基本原理，基于A和T、G和C的互补关系。它是在探针的基础上研制出的。所谓探针是一段人工合成或筛选出的已知顺序的碱基序列，样品分子上连接有一些cy3、cy5等可检测的物质。经激光共聚焦荧光显微镜检出杂交或反应信号，通过计算机处理、分析，即可获得所需信息。例如，用红、绿荧光分别标记实验样本和对照样本的cDNA，混合后与微阵列杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度(显示红色、绿色或黄色)，由此可在同一微阵列上同时检测两样本的基因表达差 异。在基因芯片工作过程中，固定位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与待测基因片段杂交，并通过自动阅读设备分析杂交结果，达到定性、定量分析 的目的。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸等生物分子实现高 效、快速、低成本的检测和分析。 基因芯片的检测主要建立在放射标记技术、荧光标记技术、质谱分析、化学发光等技术上。使用荧光标记的基因芯片需要专用的荧光扫描仪。对于高密度的基因芯 片，目前最常用的是激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD。目前专用于荧光扫描的扫描仪大致分为两类：一类是基于CCD(charge-coupled device，电荷耦合装置)的检测光子;另一类则是基于PMT(photomultiplier tube，光电倍增管)的检测系统。 生物芯片的发展得益于微细加工技术和现代分子生物技术的结合。随着人类基因组计划的实施，现代分子生物技术也取得了巨大突破：体外基因扩增技术实现了核酸 样品的快速制备和放大，基因扩增后可进行基因测序，而基因探针技术使得基因测序的检测自动化成为可能，极大地促使了生物芯片的发展。微阵列的加工借助的是 微电子工业中应用十分成熟的光学光刻技术和微机电系统加工中所采用的各种方法，根据要求在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物样品分离、反应的各 种微细结构，然后在微结构上施加表面化学处理。光学光刻的第一步是通过光学制板照相制备掩模。制备好的掩模通常是镀有铬层的石英玻璃板，该铬层事先已按微 细结构的图形被刻蚀成透光和不透光两个部分。第二步是光刻，让掩模与表面涂有光刻胶的硅片接触，然后让光源通过掩模照射到硅片上。通过显影光刻胶中的图 形，使其上未被掩模遮掩的部分被溶解除去。上述工作完成之后，通过对无胶保护的硅片用腐蚀剂蚀刻，再去除剩余的光刻胶便可获得所需生物芯片的微细结构。微 米级甚至纳米级的微细加工技术使得数以万计的生物探针(DNA片段、抗原和抗体)等微观结构成功地排列在很小的芯片载体上，从而保证了生物芯片检测的集成 化、微型化和高通量化。 2.基因芯片的分类 基因芯片是分子生物学和微细加工技术(micro fabrication technology)相结合的产物，分类方法有多种。分类的依据主要有制作方法、载体材料、载体上所固定的DNA的种类、用途等。 1)根据制作方法，可将基因芯片分为原位合成芯片与合成后点样芯片(王升启等，1999)。前者利用光引导聚合技术(1ight-directed synthesis)或压电打印法(piezoelec-tric printing)进行原位合成寡聚核苷酸探针，以美国Affymetrix公司的芯片产品为代表;后者主要利用微型机械点样法或化学喷射法将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器直接点在芯片片基上。 2)根据芯片上固定的探针数量，可以将基因芯片分为高密度芯片和中低密度芯片两类。高密度芯片上的探针数量从几万到上百万，主要是通过原位合成制备的寡核苷酸芯片，以及通过将数万个基因或者EST序列的PCR扩增产物直接点至芯片上制备的cDNA芯片。高密度基因芯片主要用于大规模的基因表达谱测定、药物筛选和新药开发、基因功能探索等方面。中低密度芯片中探针的数目一般在几十到几千不等，一般是通过合成后点样制备的芯片，主要用于基因突变分 析、基因表达谱分析等领域。基因芯片的主要特点是高通量。实际上中低密度芯片是基因芯片在临床应用上的发展趋势，原因主要是以下两点：①尽管多数疾病的影 响因素很多，但是在诊断和鉴别中的目的是具体的，所以检测需要低通量的;②中低密度芯片检测的指标较少，各指标问的相互影响作用较小，在制作工艺和检测结 果上