thermo的离子阱和蛋白质组学.pptVIP

蛋白质组学与生物质谱技术 主要内容 蛋白质组学概念及主要研究内容 蛋白质组学技术基础 蛋白质组学面临的挑战及其对策 蛋白质鉴定的主要策略及技术流程 样品前处理 色谱/电泳分离 质谱分析 数据库检索 Proteomicsn: Proven Thermo Solutions Bottum-up and Top-down 在蛋白质的水平上进行的蛋白质组学研究 理想的蛋白质组学研究模式, 当前技术攻关的热点 技术上存在困难, 近期难以实现通量化 在多肽的水平上进行的蛋白质组学研究 技术相对成熟,是当前蛋白质组学研究的主流 信息不全 蛋白质组学的基础和前提 双向电泳和多维液相色谱技术 生物质谱技术 基因组计划的完成 生物信息学技术 蛋白质组的复杂性 vs 蛋白质组学中的分离策略 离子源 EI CI FAB APCI ESI MALDI APPI ESI: Electrospray ionization MALDI：matrix assisted laser desorption ionization 质量分析器 Single quadrupole 单四极杆 Triple quadrupole 三级四极杆 Ion trap 离子阱 TOF 飞行时间 Orbitrap FTICR Q-TOF TOF-TOF Q-trap Ion trap-TOF LTQ-Orbitrap LTQ-FT … 裂解方式 CID/CAD 碰撞诱导裂解 PSD 源后裂解 SID/source fragmentation 源内裂解 IRMPD ECD ETD PQD … Why trypsin? PMF vs. MS/MS searching PMF 可以提供较高的序列覆盖率 多采用2DE-MALDI-MS配置，适用于简单样品 没有序列信息，可靠性差 已经过时 MS/MS 提供序列信息，可靠性高 多采用LC-ESI-MS/MS配置，适用于复杂样品 存在采集时间限制问题 广为接受 Separation powerPeak capacities 2DE ~500 - 10,000 protein spots Affinity Chromatography 2 Ion exchange Chromatography 10 protein level Gelfiltration 10 Reversed Phase Chromatography ~50 Ion Exchange Chromatography ~25 Reversed Phase Chromatography ~100 peptide level 2DLC (IEX/RPC) ~2,500 Linear IT MSn ~18,000 mph* Then why SCX/RP/MS? SCX和RP的分离原理是互补的 SCX按荷电情况，PR按疏水性 流动相是兼容的 pH?3，ACN/water/salt SCX流动相中的盐可以在RP时有效去除 Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留 Tryptic peptides在SCX条件下是稳定的 样品的前处理 Very important process (VIP)! 样品的损失 吸附 样品的污染 角蛋白 酶切不充分 溶液酶切和胶内酶切 … MudPITMulti dimensional Protein Identification Technology MudPIT 优点 构造简单 SCX 和 RPC 填料在同一个柱子里 自己装柱，成本较底 缺点 方法和柱子没有商业化 SCX和RPC都不在最佳状态 必须得用挥发性缓冲体系 由于需要很长的平衡时间，因而费时 on-line 2D-LC 优点 全自动 样品体积可根据后续RPC调整 在线脱盐、浓缩 自由选择缓冲盐 缺点 SCX峰容量有限 ACN浓度在IEX和RPC得一致 两相分离都没能在最佳状态下进行 off-line SCX with fraction collection 优点 两维分离都有可能在最佳状态下进行，得到最好分辨率和峰容量 可自由选择缓冲体系 样品体积可根据后续RPC调整 速度快（只需一个SCX操作） SCX馏份可留待以后分析 缺点 自动化程度低 off-line SCX 的典型结果 The secret behind sensitivityReducing column dimensions off-line 2D LC的典型实验条件 LC的上样量 实验室规模 4.6 mm ID RPC column ~ 0.2mg 2.1mm ID RPC column ~ 0.2~50