科研设计和学术论文.doc

1 研究基因转录水平主要考虑的是启动子的转录活性在审稿过程中，我接到一篇研究核苷类似物拉米夫定(lamivudine)抑制乙型肝炎病毒(HBV)X基因的研究报道. 基本的研究方法和过程如下: 首先利用分子生物学技术，构建HBV X基因的真核表达载体，如具有巨细胞病毒(CMV)早期即刻基因启动子的pcDNA3，然后用这一载体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，建立稳定转染细胞系，在细胞系的培养上清中加入拉米夫定，利用半定量的逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，检测HBV X基因的转录物水平，并进行半定量分析，结果证明HBV X基因的转录物水平有显著降低，结论是拉米夫定对于HBV X基因的转录具有显著的抑制作用. 这一篇文章的设计存在严重的问题，对于分子生物学的基本原理的理解有偏差，是不能发表的.首先我们必须明白，基因的转录调节是在基因启动子指导下进行的，基因转录水平的高低受到许多因素的影响，但是主要决定于启动子在这一系统中的转录活性，而与启动子指导的目的基因的性质没有太多的关系. 这样的设计更多的是研究了拉米夫定对于CMV早期即刻基因启动子转录活性的抑制作用，而与HBV X基因的转录没有关系. 如果本实验的目的基因换成别的什么基因，所得到的结果也同样不能说明目的基因的变化. 例如这一实验中我们将HBV X基因换成报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)，那么岂不是可以得出结论拉米夫定可以抑制氯霉素乙酰转移酶的表达了吗？显然这是不合适的.关于转录水平的研究，正确的研究方法设计应该是特定基因的启动子序列与报告基因构件成报告基因表达载体，转染合适细胞系，共同转染其他的表达质粒，或者在细胞培养上清中加入某些药物(如拉米夫定)，以研究基因表达或药物对于该基因转录表达的影响. 要研究什么基因的转录表达，即选择该基因的启动子基因序列，而不是选择其编码基因序列. 目前报告基因表达载体的构建与细胞转染模型的建立是研究基因表达调控非常常用和成熟的研究技术和策略，常用的报告基因包括CAT、b-半乳糖苷酶(b-gal，b-galactosidase)、萤虫素酶(Luc，luciferase)、和绿色荧光蛋白(GFP，green fluorescence protein)等. 报告基因CAT的检测有酶联免疫黏附法(ELISA)、同位素分析法，b-gal的检测有ELISA法和免疫组织化学染色法，Luc的表达可用化学发光法，而GFP是惟一可以在活细胞中进行观察的报告基因类型. 以上报告基因类型可以根据具体的研究条件和研究的目的进行选择. 但是，无论采用的是何种类型的报告基因，其表达水平并不代表报告基因的调控，而是代表了报告基因上游的启动子的转录活性水平. 利用报告基因表达载体的三究技术，具有很多的优点，其一可以避开内源和外源基因表达水平的影响. 例如，研究一种基因的转录水平表达而进行报告基因表达载体的构建和细胞转染，如果表达产物是基因编码产物本身，就难以区别内源性基因的编码水平或者是外源转染基因的表达水平. 采用报告基因就可以解决这一问题，因为采用的报告基因类型是细胞本身不表达的产物，因此，对于报告基因编码产物的检测水平可以精确地反映基因启动子的转录活性，不会受到内源性基因表达产物水平的影响. 第二，如果研究不同基因启动子的转录活性，采取本身基因表达产物的检测方法，必须建立各种基因表达产的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不具备，或者很难建立，但是如果采用报告基因的研究策略就很容易解决这一问题，只要建立稳定的报告基因表达的检测技术就可以应用不同基因启动子转录活性的检测和研究. 这也正是基因转录表达研究策略中非常成熟和公认的做法.2 肝炎病毒准种特点是一个不能忽视的问题乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒(HCV)存在状态时准种(quasispecies)状态，这是一个不能忽略的问题. 在研究抗病毒治疗前后的病毒的基因序列改变的研究中尤其要注意病毒基因准种的特点. 例如，一篇论文研究慢性乙型肝炎的抗病毒治疗前后的病毒基因序列的改变，治疗前留取患者的血清，抗病毒治疗后再一次留取血清，由两份血清提取HBV DNA，应用聚合酶联反应(PCR)技术进行扩增，扩增的HBV DNA片段进行克隆化，各挑取1个克隆进行序列分析，结果发现2个序列存在差别，因此就判定抗病毒治疗前后病毒的基因序列发生了改变，而且认为这种改变与抗病毒治疗的效应有关. 如果慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后的HBV基因序列始终各自都是均一的病毒基因序列，或许这种研究方法是可行的，但是，事实上HBV基因序列有准种特点，就是说慢性乙型肝炎患者血清中的病毒，其基因序列，不同的病毒株之间十分相似，但又不同，这种相似性达到95%以上，差别占总核苷酸数的5%以下，这种差别较小，还不足以分成不同的血清型，也不足以分