抗Ⅳ型胶原酶单域抗体V-%2cH-导向力达霉素基因工程菌株构建及融合蛋白CagA-V-%2cH-表达的研究.docx

北京协和医学院博士研究生学位论文  中文摘要  白的表达量。构建重组质粒ｐＢＳＡ，将质粒接合转移至＆ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ Ｃ一１０２７中， 采用同源重组双交换的方法将ｃａｇＡ基因阻断。通过抗性筛选、ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  验证，最终获得辅基蛋白阻断株，命名为＆ｇｔｏｂ／ｓｐＯ／ＵＳ ＡＫＯ。用四种辅基蛋白表达 质粒ｐＫＣＴＡ９００、ｐＳＥＴＴＡ９００、ｐＬＴＡ９００和ｐＬＴＡ４００分别导入在自身启动子和／  或强启动子控制下的ｃａｇＡ基因对阻断突变株Ｓ ｇ／ｏｂ卸ＯＦＵＳ ＡＫＯ进行互补，得到 相应的互补菌株。对阻断株和互补菌株进行发酵，发酵液的抑菌活性和ＨＰＬＣ分析 结果表明阻断株完全丧失了力达霉素的产生能力，而互补菌株能不同程度地恢复产 生力达霉素，其中＆ｇｌｏｂｉｓｐＯＩ＇ＵＳ ＡＫＯ／ｐＫＣＴＡ９００基本恢复到野生株的水平。将质 粒ｐＫＣＡ９００、ｐＳＥＴＡ９００、ｐＬＡ９００和ｐＬＡ４００接合转移至野生株最ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ Ｃ．１０２７中构建了相应的辅基蛋白过表达菌株。抑菌活性和ＨＰＬＣ分析结果表明过 量表达ｃａｇＡ基因可以提高力达霉素的产量。 构建辅基蛋白．单域抗体的融合蛋白表达质粒ｐＫＣＴＨ２６００、ｐＳＥＴＴＨ２６００分别 导入辅基蛋白阻断株中进行表达。重组菌株＆ｇｔｏｂ卸Ｏ／＇ＵＳ ＡＫＯ／ｐＫＣＴＨ２６００发酵液 的抑菌活性在发酵晚期与野生株相当，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析在胞内、胞外均能检测 到融合蛋白的特异条带。ＥＬＩＳＡ检测到融合蛋白的免疫活性。结果表明融合蛋白在 辅基蛋白阻断株中以多拷贝质粒的形式获得表达且表达量较基因工程菌株＆  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ Ｃ一１０２７  ＶＨ和＆ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ  Ｃ一１０２７  ＮＶＨ明显提高。 综上所述，本工作通过优化融合基因的表达策略，提高了融合蛋白的表达水平， 为获得抗ＩＶ型胶原酶单域抗体ＶＨ导向的力达霉素奠定了基础，为进一步构建高表达 的导向力达霉素重组菌株提供了新的技术平台。 ５  北京协和医学院博士研究生学位论文  Ａｂｓｔｒａｃｔ  英文摘要  Ｌｉｄａｍｙｃｉｎ（Ｃ一１ ０２７），ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ Ｃ一１ ０２７，ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ ｅｎｅｄｉｙｎｅ ａｎｔｉｔｕｒｎｏｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ｈａｓ ｅｎｔｅｒｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｒｅｃｅｎｔｌｙ．Ｌｉｄａｍｙｃｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ  ａ １：１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ａｎ ａｃｉｄｉｃ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＣａｇＡ）ａｎｄ  ａ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｕｎｄ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ．Ｉｔｓ ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ １ ０，０００ ｔｉｍｅｓ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈａｎ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ ｉｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｂｕｔ ｈｉｇｈｌｙ ｌａｂｉｌｅ ａｎｄ ｉｎｓｔａｂｌｅ，ａｎｄ  ＣａｇＡ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｓ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ．ＣａｇＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ  ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｕｍｏｒ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ． Ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＶ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｉｓ ａｎ ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｍＡｂ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｔｉ－ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｍａｙ ａｃｔ  ａｓ ａ ｃａｒｒｉｅｒ ｏｆ ｄｒｕｇ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ  ａｎｔｉ—ｔｙｐｅ ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｅｎｅ，ｉｔｓ