磷胁迫下油菜子叶、茎及其根系分泌蛋白双向电泳的分析.docxVIP

摘要摘要磷素是植物所必需的维持其生命特征的主要营养元素之一，土壤有效磷缺乏是世界范围内影响农作物产量和品质的主要非生物胁迫因子之一。油菜作为中国油料供应的重要经济作物之一，它的高产量和高品质一直是人们关注的焦点。然而，油菜受到磷缺乏的影响，很难发挥其优势潜力，鉴于此种状况，人们通过大量施肥来解决磷缺乏的问题，同时，也带来了一系列的环境污染问题，这极其不符合可持续发展战略的要求。因此，开展油菜响应磷胁迫机制的研究，挖掘油菜自身高效利用磷营养的种质资源，已成为目前研究的重点和热点。传统的研究方法多集中在基因领域，难以揭示油菜响应磷胁迫的综合机理。随着后基因组学时代的来临，蛋白质组学应运而生，蛋白质是生物生命现象和生理功能的直接执行者，所有生物的细胞、器官和组织的生命活动都是由组成其各个部分的蛋白质所支撑的。因此，可以利用蛋白质组学技术来研究磷胁迫下油菜的变化机制。本研究以甘蓝型油菜鼎油杂４号为试验材料，利用缺磷营养液模拟磷胁迫，在前人建立的自制管状胶双向电泳技术体系的基础上，建立了根系分泌蛋白的提取体系，并进一步研究了油菜响应磷胁迫的幼苗子叶、茎以及根系分泌蛋白的双向电泳图谱差异表达，期望有助于后续的磷胁迫下油菜幼苗相关分子机理的研究。主要研究结论如下：（１）、初步建立了适用于研究油菜根系分泌蛋白的无菌水培体系。本研究在传统的水培体系基础上，对培养仪器和培养液进行高温灭菌，实验操作在单人双面净化工作台上进行，使其达到无菌状态，同时采用微生物检测技术对培养液进行无菌检测，确保根系分泌蛋白的提取完全无菌，为后续实验的进行提供了优良的实验材料。（２）、初步建立了根系分泌蛋白的提取方法。本实验在传统的ＴＣＡ．丙酮蛋白提取法的基础上，经过改进优化，初步建立了一种油菜根系分泌蛋白的提取方法。在蛋白质的提取过程中增加了低速离心除杂和脱氧胆酸钠与ＴＣＡ协助浸提两个新的步骤，提取的蛋白经过裂解定量以及双向电泳技术，获取了较好的双向电泳结果，这表明，此方法适用于根系分泌蛋白的提取。摘要（３）、利用自制管状胶双向电泳技术，对磷胁迫下油菜幼苗的子叶及茎蛋白进行了双向电泳分离，获取了背景清晰的凝胶图谱。应用ＰＤＱｕｅｓｔ８．０．１软件对图谱进行分析表明：差异蛋白表达稳定性良好，其中子叶蛋白共计有１８５个蛋白点得到匹配，上调表达２２个，下调表达３０个；茎蛋白共计有１８４个蛋白点得到匹配，上调表达２３个，下调表达２２个。（４）通过建立的蛋白提取方法获取了纯度较高的根系分泌蛋白，通过双向电泳技术将其分离，得到了重复性较好的凝胶图谱。通过质谱分析，成功鉴定了２个蛋白点，分别为几丁质酶ＣｌａｓｓＩＶ和半胱氨酸蛋白酶。关键词：甘蓝型油菜；磷胁迫；蛋白质组学；双向电泳ＩＩＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＰｈｏｓｐｈｏｒｕｓｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｉｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔｓｗｈｉｃｈａｌｅｎｅｅｄｅｄｂｙｐｌａｎｔｓｔｏｍａｉｎｔａｉｎｔｈｅｉｒｌｉｖｅｓ．ｔｈｅｌｏｗｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｉｎｓｏｉｌｓｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｊｏｒａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓｗｈｉｃｈｌｅａｄｓｔｏｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｉｍｉｔｅｄａｎｄｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｒｅｃｅｄｅｄｏｎａｗｏｒｌｄｓｃａｌｅ．ＡｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｏｉｌｃｒｏｐｓｉｎＣｈｉｎａ，Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｄｏｅｓｎｏｔｐｅｒｆｏｒｍｗｅｌｌｅｘｐｏｓｅｄｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ。Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｔｒｅｓｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｆｏｒＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｔｏｒｅｌｅａｓｅｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｉｓｓｉｔｕａｔｉｏｎ，ｐｅｏｐｌｅｓｏｌｖｅｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｂｙｓｐｒｅａｄｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｅｒｔｉｌｉｚｅｒ，ｗｈｅｒｅａｓ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｌｕｔｉｏｎａｐｐｅａｌ，ｗｈｉｃｈｉｓｎｏｔａｃｃｏｒｄｗｉｔｈｔｈｅｄｅｍａｎｄｏｆｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｈｏｗｔｏｉｍｐｒｏｖｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｕｔｉｌｉｚｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｔｈｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆｕｓｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｓａｈｏｔｆｏｃｕｓｏｆｃｕｒｒｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｇｅｎｅｓ，ｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｒｅｖｅａｌａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ