原核表达及抗体制备.docVIP

猪精子黏附蛋白AWN、PSP、MCP的原核表达及抗体制备 实验材料 15日龄杜洛克猪大肠杆菌E. coli DH5α克隆菌株 大肠杆菌E. coli BL21表达菌株 主要试剂 来源 公司质粒小提试剂盒 Omega公司 Omega公司 公司 北京全式金公司 EcoRⅠ和限制性内切酸酶 NEB公司 EB核酸染料 Bio Teke 公司 DNA marker（D2000） 东盛公司 5xTAE 本实验室保存 IPTG Merck公司 （Amp） Tiangen公司 中分子量预染蛋白arker 鼎国昌盛公司 乙醇（分析纯） 杨凌三立化玻 醋酸（分析纯） 杨凌三立化玻 考马斯亮蓝-250 Amresco公司 丙烯酰胺（Bis-Acr） Amresco公司 过硫酸铵（AP） Amresco公司 灭菌水 本实验室自制 提取睾丸组织DNA（DNA抽提试剂盒） 2.PCR扩增Awn部分外显子基因 Genbank数据库得知，猪的基因bp，共有外显子，实验目的三对overlap扩增引物其中Awn-F，Awn-R扩增的是第2部分序列和第外显子设计产物大小bp；Awn-1和Awn-2扩增第外显子设计产物大小bp；Awn-3和Awn-4扩增第外显子大小bp。 表1.引物序列 名称 引物序列 大小 Awn-F ATGGGTCGCGGATCCGAATTCGCATGGAACAGAAGGTCTCGTTCCTGTGGCG 52bp Awn-R CTCCTTCCCGCAGCTGAGGTTGAGAGGCGGTATTGCCAG 39bp Awn-1 CTGGCAATACCGCCTCTCAACCTCAGCTGCGGGAAGGAG 39bp Awn-2 AGTAAGGAAAAGGTAAGGGGCCTTCTGGATCAGCATAGTAATAT 44bp Awn-3 ATATTACTATGCTGATCCAGAAGGCCCCTTACCTTTTCCTTACT 44bp Awn-4 CTCGAGTGCGGCCGC AAGCTTAGGGATGTTTTTCTCTGTAG 41bp PCR反应体系如下（50μl反应体系） 组分 添加量 5xPCRstimulant 10μl 5xTransStart FastPfu Buffer 10μl dNTPs 5μl 上游引物Awn-F/Awn-1/Awn-3 1μl 下游引物Awn-R/Awn-2/Awn-4 1μl 猪睾丸DNA 1μl 灭菌水 21μl TransStart FastPfu DNA Polymerase 1μl PCR反应条件如下 94℃(预变性) 2min 94℃（变性） 20s 58℃（退火） 20s 72℃（延伸） 20s 循环次数 30个 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖0.2g，TAE20ml，120V电泳。对应Marker，鉴定目的条带的大小。 3.外显子PCR产物进行切胶回收纯化 外显子基因进行Overlap-PCR 5xPCRstimulant 5μl dNTPs 5μl 引物Awn-F 1μl 引物Awn-4 1μl 模板Awn RF 0.88μl 模板Awn1、2 1μl 模板Awn3、4 1.47μl 灭菌水 23.65μl TransStart FastPfu DNA Polymerase 1μl PCR反应条件 94℃(预变性) 3min 94℃（变性） 20s 58℃（退火） 20s 72℃（延伸） 15s 循环次数 30个 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,之后对目的片段切胶回收。回收的DNA放入-20℃冰箱中保存。 5.提取pET-28a质粒DNA（质粒小提试剂盒） 将本实验室保存的含有pET-28a大肠杆菌的菌株从冰箱拿出来，取5μl菌液加入到10mlLB液体培养基，并加入10μl卡那霉素。封好管口，37℃恒温摇床，220rpm，过夜培养12h。 第二天取4ml LB液体培养基内培养过夜的细菌，12000rpm，室温离心2min,弃上清； 加250 uL SolutionⅠ悬浮细菌沉淀，移液枪吹打至沉淀均匀悬浮，无残留菌块。 加250 uL SolutionⅡ，温和并充分地上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，得到澄清溶解产物。此步骤控制在5min内，以避免因裂解过渡导致质粒DNA断裂，并且2min的孵育很重要。 加350 uL SolutionⅢ，立刻混匀，产生白色沉淀，大于13400g，常温离心10 min。 1mL的移液枪吸取离心后的上清液，确保没有杂质，转移到吸附柱中，10000g，常温离心1min，弃滤液。 在吸附