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第18章 基因工程基础 教学大纲基本要求 用工具酶、克隆载体与表达系统；基因克隆的一般原理与过程，目的基因的分离，目的 基因的克隆；克隆基因的表达；因表达的控制元件，外源基因在原核系统中的表达；外源基因在真核系统中的表达。 本章知识要点 （一）基因工程概念 基因工程是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程的核心技术是DNA重组。蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的，它是指通过对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。 基因工程开辟了生物学研究的新纪元。借助基因工程，分子生物学的发展达到空前的速度和规模，新的研究领域不断被开拓。“人类基因组计划”是生物学历史上最巨大的科学工程；后基因组的时代已经到来。 基因工程带动了生物技术产业的兴起。制药、化工、食品、农业和医疗保健业无不得益于基因工程。基因工程帮助人类认识和改造生命世界，也帮助人类认识自己。设计和创建新的基因、新的蛋白质和生物新的性状的时代。 （二）分子克隆的基本原理 克隆(clone)意为无性繁殖系。DNA克隆即将DNA的限制酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，以获得相同的DNA扩增分子。故DNA克隆为分子克隆。 1(isoschizomers)；切割产生单链末端相同的限制酶，称为同尾酶(isocaudamers)。相容（compatible ende）的限制片段可用DNA连接酶(DNA ligase)相连接。平末端连接效率较低，利用接头(linker)、衔接物（adaptor）或在平末端加上互补均聚物可以帮助平末端连接。合成的含限制酶识别位点的ＤＮＡ片段（接头）通常是一条回文结构（palindrome）的寡核苷酸，在溶液中自身配对成为双链片段。例如：EcoRI的接头为GGAATTCC；Hind III的接头为CCCAAGCTTGGG。限制酶的切割位点靠近ＤＮＡ片段的末端时其活性将受影响，不同限制酶所受影响不同，因此限制酶的接头通常要比识别序列长，EcoRI的接头八核苷酸就足够了，而Hind III的接头十二核苷酸仍然酶切不完全。当合成的片段含有不只一种限制酶的识别序列，则称为多接头(polylinker)。如果合成两条互补的寡核苷酸，使其配对后一端为平末端，另一端为粘性末端，或两端为不同的粘性末端，此合成的片段称为衔接物。衔接头可以使ＤＮＡ片段的平末端转变为粘性末端，或由一种粘性末端转变为另一种粘性末端，并且无需用限制酶切，在基因工程中十分有用。 2、分子克隆的载体与宿主系统 将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具，称为载体（vector）。克隆载体通常是由质粒、病毒或一段染色体DNA改造而成。大肠杆菌载体主要有：质粒载体、λ噬菌体载体、柯斯质粒和丝状噬菌体M13载体等，它们能够携带的外源DNA片段大小不同，用途也各异。宿主细胞根据载体的性质来选定。 将外源DNA导入宿主细胞，从而改变细胞遗传性状，称为转化；将病毒DNA直接导入细跑，称为转染。用氯化钙处理大肠杆菌细胞，使处于感受态，可以促进转化。λ噬菌体和柯斯质粒的重组体在体外包装后可用以感染大肠杆菌，柯斯质粒在大肠杆菌细胞内以质粒形式存在。外源DNA导入真核细胞常用DNA复合物、脂质体、电穿孔等方法。 3、基因文库的构建 基因文库是指整套基因组DNA片段分子克隆的总体。基因文库的构建包括基因组DNA的随机片段化、载体DNA的制备、重组体DNA的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤。 由于真核细胞的基因是断裂的，只有用它的mRNA经逆转录获得cDNA，才能得到连续的编码序列。 细胞全部mRNA的cDNA克隆之总体，称为cDNA文库。从文库个筛选基因或cDNA克隆主要依据重组体的特征、原位杂交或表达产物的性质。 4、聚合酶链反应 聚合酶链反应(PCR)借助一对引物，在耐热DNA聚合酶作用下，通过多轮酶促反应，使基因序列得到指数级的扩增。PCR技术因其检测和扩增基因十分快速高效，并互简单易行，而被广泛用于生物学、医学、刑侦和其他有关领域。 （三）克隆基因的表达调控 基因表达的主要控制元件有：启动子和有关的调控序列、核糖体结合位点、转录终止信号和终止密码子等。外源基因在宿主细胞内可以非融合蛋白形式表达，也可以融合蛋白形式表达。在信号肽的引导下表达蛋白可以穿过细胞膜，分泌到细菌的周质或培养基中。外源蛋白较高水平表达时常产生不溶性的包涵体。为便于操作，真核生物表达载体通常都含有在大肠杆菌中复制的起点，因此都是穿梭载体。酵母菌的克隆和表达载体常用整合质粒、附加体质粒、复制质粒构建而成。为克隆基因组DNA大片段，常用酵母人工染色体(YAC)。植物基因工程