聚丙烯酰胺凝胶电泳检测几种蛋白质产品的纯度.ppt

生物化学实验实验十一 实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测几种蛋白质产品的纯度 一、实验目的和要求 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 三、实验器材与试剂 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 五、实验结果与讨论 六、思考题 一、实验目的和要求 1、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 2、掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的 基本操作。 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 （一）什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳？ （二）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及特性 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离蛋白质的原理 （一）什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳？ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，Bis）在催化剂作用下合成的。 （二） PAGE聚合原理及特性 1、 PAGE聚合反应 2、凝胶性能与总浓度及交联度的关系 3、凝胶浓度及Bis含量与孔径的关系 4、凝胶浓度与被分离物分子量的关系 1、 PAGE聚合反应 化学聚合（AP-TEMED体系） ①TEMED催化AP生成硫酸根自由基 ②硫酸根自由基激活Acr单体形成长链 ③Bis将单体长链连成罔状结构 光聚合（核黄素-TEMED体系） ①在TEMED和光照下核黄素转变成无色还原型 ②在O2的作用下形成核黄素自由基引发聚合反应 化学聚合和光聚合的特点比较 化学聚合（AP-TEMED体系） 化学聚合（AP-TEMED体系）续 影响聚合的主要因素 a.引发剂和增速剂的浓度： 浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。 b.系统pH值： 酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果； c.温度： 低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性； d.分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 e.系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合； 2、凝胶性能与总浓度及交联度的关系 3、凝胶浓度及Bis含量与孔径的关系 标准胶 在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。 4、凝胶浓度与被分离物分子量的关系 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 不连续凝胶电泳的分离效应 1、凝胶电泳操作-制胶过程 2、凝胶电泳操作 -电泳槽及胶管的安装与电泳 3、系统的不连续性表现 4、分离机制 1、凝胶电泳操作-制胶过程 2、凝胶电泳操作-电泳槽及胶管的安装 电 泳 3、系统的不连续性表现 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。 4、不连续电泳原理示意图与分离机制 三、实验试剂与器材 实验器材 稳压直流电源(300-500V，电流50～100mA)；圆盘电泳槽及玻璃管0.5×7～10cm(×12)；夹心式垂直板电泳槽、凝胶模及玻璃板（135×100×1.5mm）；烧杯（25，50，100mL各1个）；真空泵及真空干燥器；日光灯；注射器10m1(×1)；针头；滴管；培养皿直径Φ120cm(×3)；移液管1 m1(×1)、2mL(×1)、5m1(×1)；移液枪（1ml）。 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 制胶过程 电泳槽及胶管的安装 电泳 电泳结果 1、制胶过程 1、将内径0.5cm长7～10cm的玻管切口磨光，洗液浸泡后，水洗净烘干，下端套上青霉素瓶塞，垂直立于实验台