生化药物与基因工程药物分析.pptVIP

（三）光谱法 2.紫外分光光度法：生物制品或相关的反应产物的紫外光谱在某一特征波长处有最大吸收，且一定的浓度范围内与相应的吸光度成正比，则可用于生物制品的含量测定 （三）光谱法 3.荧光分光光度法： 利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。该法灵敏度高(通常比紫外分光光度法高2～3个数量级)，选择性好。 （四）高效液相色谱法 具有高效分析、灵敏检测、操作简便的优点 分离过程中不破坏分离样品的特点 适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生物制品的定量分析 二、生化分析法（一）酶法 以酶为分析对象的分析：酶活力测定法 目的是测酶的活性或活力 以酶为分析工具或分析试剂的分析方法：酶分析法 主要测定样品中酶以外其他物质的含量 1）基本概念： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。 酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。 1.酶活力测定法 1）基本概念：酶单位：任何一种酶，在25℃以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位（国际单位，IU）  1.酶活力测定法 1）基本概念：酶的比活性：为每毫克蛋白质所具有的酶单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。  1.酶活力测定法 酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。  2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。 3）测定方法：取样测定法、连续测定法 取样测定法：在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据底物和产物在化学性质上的差异，用适当的检测方法进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。 连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续监测的方法。 4）酶活力测定的方法 检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。 2.酶分析法 分析对象是酶的底物、辅酶活化剂、酶的抑制剂。 1.动力学分析法 2.总变量分析法本法又称为平衡法或终点法。 仅适用于底物的测定。 （二）电泳法 电泳法可分为三大类：自由界面电泳、区带电泳、高效毛细管电泳（HPCE)。根据所用支持物的不同分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、PAGE法、SDS法、琼脂糖凝胶电泳法 1、自由界面电泳： 在一根U形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。 2、区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。常用的支持物有：滤纸、醋酸纤维素薄膜、聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）、十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶（SDS - PAGE ）。 3、高效毛细管电泳法（HPCE） 在一根内径约50um的毛细管中，在高压电场下进行样品分离分析的一种新型电泳技术。 三、生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 1、生物药物含量的测定 测定对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物可用生物检定法来控制药物质量。如洋地黄、胰岛素、肝素及各种抗生素。 2、大分子结构的测定 某些生物制品因结构复杂、分子量大，而且由结构类似、比例不定的多种成分组成，很难用理化方法反映其生物活性；某些药物虽可用理化方法测定含量，但不能完全反映效价。以上药物均采用生物检定。 3、微量生理活性物质的测定 一些神经介质，激素等微量生理活性物质，由于其很强的生理活性，在体内浓度很低，加上体液中各种物质的干扰，很难用理化方法测定。而不少活性物质的生物测定法因灵敏度高、专一性强，对供试品稍作处理即可直接测定。 第十六章