新型HIV-1核酸定量内标构建及验证.pdf

·20 · 寒 I堕壁 墨查皇王 !丝旦箜!鲞兰塑 垦xp InfectDis(ElectronicEdition),Februmy2017，Vo1．11，No．1 · 基 础 论 著 新型HIV-1核酸定量 内标构建及验证 李庆 刘芳 岳秀娟 ’ 李冰 陈德喜 【摘要】目的 构建一种稳定的以病毒颗粒为基础的HIV核酸定量检测内标。方法 在实验室原有 新型表型耐药载体pcDNA6．2一LTRgagpol的基础上，利用PCR扩增法在不改变p24保守区基础上突变核 苷酸 ，经Gateway重组得到含突变碱基的pNL43一AENV-LUC—ATTR表达载体，该载体与水泡性 口膜炎 病毒 (VSV)质粒共转染293细胞48h后收集上清中HIV-1内标假病毒颗粒，检测p24抗原含量，定量假 病毒滴度 ，以倍比稀释内标质粒、内标质粒与阳性标本混合品、内标假病毒颗粒与阳性标本混合品为 模板进行实时定量PCR法，观察 内标质粒、内标假病毒颗粒 内的核酸与内标引物探针的匹配情况，以 及是否受样本探针引物的干扰。结果 定点突变表型耐药载体pcDNA6．2．LTRgagpol~的p24保守区片 段：获得仅具有1次感染性的HIV-1假病毒颗粒 (3．61×10IU／m1)；p24抗原检测含量为283．2pgm／l； 实时定量PCR法确定内标质粒、内标假病毒颗粒内的核酸与内标引物探针匹配 良好，内标引物探针对 阳性标本探针无干扰。结论 成功建立了一种以假病毒颗粒为基础的HIV-1核酸定量检测内标。 【关键词】获得性人类免疫缺陷病毒1型；核酸定量；病毒颗粒；内标 ConstructionandverificationofanovelHIV-1nucleicacidquantitativeinternalstandardLiQing， LiuFangt ． YueXiujuanlLiBingz．ChenDexil1BeijingInstituteofHepatology,2OfficeofReformand Performance,BeoingYouanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beoing100069,China Correspondingauthor．ChenDexi，Email：dexichen@ccmu．edu．cn 【Abstract] ObjectiveToconstructastableHIV-1nucleicacidquantitativedetectionofinternal standardbasedonvirusparticles．M ethods p24regionwasmutatedwithoutchangingp24conservative districtandinsertedintophenotyperesistantvectorpcDNA6．2一LTR gagpolbyPCRamplificationmethod， followingbytheconstructionofpNL43-AENV-LUC expressionvectorcontainingthespecificmutation basebyGatewayrecombinanttechnology．ThisvectorandVSV plasmidwerecotransfectedinto293T celllinesandHIV-1pseudotypedviruswascollectedfrom thesupematant48hourslater．Theloadsof HIV-1werequantifiedbydetectionofp24antigentiters．Themultiproportiondilutedliquidsoftheinternal standardplasmid，themixtureoftheinternalstandardplasmidandpositivesamplesandthemixtureofthe internalstandardpseudotypedviralparticlesandpositivesampleswereusedasthetemplateforthereal—time quantitativePCR tov