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间接法ELISA SOP 一、包被 1．抗原包被量为20μg/板。 2．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。 3．取25μl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100μl/孔。 4．包被完毕后，4℃过夜。 二、封闭 1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。 2．加封闭液，200μl/孔。 3．37℃孵育2h。 4．甩干，洗板（3次）。 5．用干燥的自封袋4℃保存。 【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200μl -300μl洗板液，静置2min，甩出，将板拍在干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。 三、一抗 1．可洗板一次。 2．阳性对照：1μl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1：1000稀释（第一孔）。 3．阴性对照：做1：2万稀释。 用1μl阴性血清加入100μl抗原稀释液中，先做1：100稀释。再从此液 取出5μl加入995μl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。 4．空白对照：只加抗原稀释液。 5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100μl抗原稀释液。 6．第一孔加100μl（1：1000）的阳性对照。 7．第二孔加100μl（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100μl加到3号孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。 1：1000 1：2000 1：4000 1：8000 1：16000 1：32000 阴性对照（1：2万） 空白对照 8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。 【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数(一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易)。 ②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。 ③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。 四、二抗 本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1．用0.01MPBS做1：5000稀释（现用现配）。 2．100μl/孔。 3．酶标板37℃孵育30min, 洗板3次。 【注】：采用的二抗的所抗的物种应当与一抗的来源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗就应该选择羊抗兔或者是其他种属抗兔的酶标二抗。 五、显色 1．显色液参照底物配制表。 总体积 (ml) 10 8 6 4 2 A+B混合液(ml) 10 8 6 4 2 TMB (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.75%H2O2 (μl) 32 25.6 19.2 12.8 6.4 2．100μl/孔。 3．酶标板37℃孵育15min，不洗板，直接加终止液。 【注】：①最后显色阳性、阴性、空白都没有一点颜色，很有可能是二抗或者显色剂出了问题。其次还有可能是包被或封闭出了问题，那最后只能是一抗不能和抗原结合了（可能性较小）。 ②最后显色阳性、阴性、空白都有颜色，可能是，（1）阳性的显色结果是非特异结合；（2）阴性稀释不够，或者本身阴性血清就含有可以和抗原结合的物质（动物的个体差异造成）；（3）洗板没洗干净，可以增加洗板次数和时间，提高洗板效果。 ③出现“跳孔”即，抗体的吸光值并不是根据稀释梯度逐级递减，可能是在做梯度稀释的时候出现了失误（一般新手的较易出现这种情况）。 六、终止 终止液为2M的H2SO4。 100μl/孔，终止后立即用酶标仪检测，波长为450nm下记录实验结果。 分析抗体效价。 如， 稀释倍数 抗体 1:500 3.138 1:1000 2.957 1:2000 2.351 1:4000 1.644 1:8000 1.047 1:16000 0.611 阴性1：2万 0.096 空白 0.094 【注】：我们把抗体的吸光值大于1的稀释倍数，认定为有效加的。最接近1的那个稀释倍数为该抗体的效价。如本图，该抗体的效价为1:16000。 我们的认定方法和教科书上规定的方法不同，但是教科书上的方法过于理想化，根据普遍的各个实验室的实际经验来看，我们才采用了上述方法来判定抗体的效价。 附录1 ELISA液配方 包被液【10×CBS】 （pH9.6） 配制量 1L 配制方法 1.称量下列试剂，置于1L烧杯中。 Na2CO3 15.9g 150mM NaHCO3 29.3g 350mM 2.调节pH值至9.6，dH2O定容至1L。 3.4℃保存。 抗原量：200ng/孔，20ug/板。