第五章 生物制品制造工艺2.ppt

§3 DNA重组药物 尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白等杂质，并避免在纯化过程带入有害物质 纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收率等等 1）、产品的鉴别 氨基酸组成分析： 肽图分析： N末端和C末端氨基酸测序： 蛋白质二硫键的分析： 重组蛋白相对分子量： 等电点的测定： 2）、纯度分析：SDS, CE, IEF, HPLC 3）、生物活性测定 4）、残余杂质检测 宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等 5）、安全性检测 无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查 A 体内生物学活性测定方法 生物学模型 生长激素 大鼠 脑垂体 B 体外生物学活性测定方法 如： MTT法: MTT formazan (蓝紫色) 干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干扰素的体外活性。 琥珀酸脱氢酶 五、重要的重组DNA药物 （一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽 代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片断等。 效率高、产量大 周期短、成本低 工艺稳定、质量可控 缺点是易形成包含体 1）、干扰素（IFN-α、β、γ） 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。 根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 1986年，FDA批准Roch公司的重组IFN-α2a和Schering公司的重组IFN-α2b，重组IFN-β、γ分别在1990年和1993年上市。 我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰素主要为IFN-α1b型，1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获得国家一类新药证书。 2）胰岛素(Insulin, Ins) 1921年，Banting FG等从胰脏中分离 1955年，Sanger F测序 1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成 1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因 1982年，第一个重组人胰岛素批准上市 胰岛素的结构及生物合成 胰岛素原与胰岛素 人胰岛素的生产方法 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略 (a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有10～20％ (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80％以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。 (c) AB链同时表达法 Ins A链 Ins B链 转化大肠杆菌 发酵 A链 B链 纯化 二硫键 活性胰岛素 AB链合成人胰岛素 质粒 Ins mRNA 反转录 Ins cDNA 转化大肠杆菌 PCR 连接 胰岛素原 活性胰岛素 二硫键 酶切 提取质粒 限制性内切酶酶切 反转录酶法合成人胰岛素 3）生长激素 1944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素 1956年，从人垂体中分离出hGH 1969年，hGH序列报道 临床上用于垂体性侏儒症。1956~1985年，只能从人尸体垂体中分离纯化。但至1985年，共发现50多例克-雅氏症，5人病亡，研究结果证实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒。 1985年，垂体来源的被禁用，同年，rhGH上市。 1985年，美国FDA批准由大肠杆菌发酵生产的重组人生长激素上市，随后各种途径生产的重组人生长激素迅速充斥市场。1997年，仅美国Genentech和Ely Lily两家公司的重组人生长激素年产量已达20kg，年销售额超过3.5亿美元。 人生长激素的结构与性质 重组人生长激素工程菌的构建 （二）利用重组酵母生产医用蛋白 优势： 1.最简单的真核生物，基因表达调控机理较清楚，并且遗传操作相对较为简单； 2.具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 3.不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌在食品工业当中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统； 4.大规模发酵工艺简单，成本低廉 5.能将外源基因表达产物分泌至培养基中 劣势：虽然拥有完整的蛋白质糖基化修饰系统，但其修饰方式不用于高等真核生物。 举例：重组乙肝疫苗 重组人血清白蛋白 重组HAS的制备 人血清白蛋白HAS是血浆中的主要成分 载体蛋白。成熟的人血清白蛋白为一非糖基化的单一多肽链，由585个氨基酸组成，含有17对二硫键，由此维系的空间构象是血清白蛋白