湘西蛇足石杉石杉碱含量及石杉碱甲生物合成LDC基因的克隆与功能表征.pdfVIP

目录 2.3.3 精密度试验 17 2.3.4 重复性试验 17 2.3.5 稳定性试验 18 2.3.6 加样回收率试验 18 2.3.7 样品石杉碱含量测定 18 2.4 结论与讨论 错误!未定义书签。 第3 章 赖氨酸脱羧酶基因的克隆及生物信息学分析 21 3.1 材料与试剂 21 3.1.1 试剂 21 3.1.2 仪器 21 3.1.3 培养基 22 3.1.4 材料 22 3.2 方法 22 3.2.1 总RNA 提取及cDNA 合成 22 3.2.2 LDC 基因全长扩增 23 3.2.3 JM109 感受态细胞的制备 24 3.2.4 PCR 产物的TA 连接 24 3.2.5 转化与筛选 24 3.2.6 重组质粒提取及测序 25 3.2.7 LDC 基因的信息学分析 25 3.3 结果与分析 25 3.3.1 LDC 基因的克隆和序列分析 25 3.3.2 LDC 编码蛋白的特性及结构预测 27 3.3.3 信号肽及亚细胞定位及跨膜区域预测 28 3.3.4 不同植物LDC 氨基酸序列比对 28 3.4 结论与讨论 29 第4 章 赖氨酸脱羧酶基因的外源重组表达及功能表征 31 4.1 材料与试剂 31 4.1.1 试剂 31 4.1.2 仪器 32 4.1.3 培养基 32 4.2 方法 32 4.2.1 目的基因插入片段获得 32 4.2.2 重组质粒DNA 构建 33 4.2.3 外源重组DNA 的转化及阳性克隆子筛选 34 II 第 页 目录 4.2.4 重组质粒DNA 原核表达 35 4.2.5 表达产物SDS检测分析 35 4.2.6 重组表达产物制备及定量 37 4.2.7 纯化表达产物的活性鉴定 37 4.3 结果与分析 38 4.3.1 赖氨酸脱羧酶基因的重组 38 4.3.2 重组赖氨酸脱羧酶的原核表达 39 4.3.3 Trx-LDC1 和Trx-LDC2 的可溶性表达及纯化 40 4.3.4 重组赖氨酸脱羧酶的活性鉴定 41 4.4 结论与讨论 41 第5 章 湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲分布及与LDC 表达的关系 43 5.1 仪器与材料 43 5.1.1 试剂 43 5.1.2 仪器 43 5.1.3 材料 43 5.2 方法 43 5.2.1 不同部位石杉碱甲含量测定 43