黑曲霉原生质体形成与再生影响因子的研究.pdfVIP

安徽农业大学学报, 2003, 30 (3) : 333～ 336 Journal of A nhui A gricultural U niversity 黑曲霉原生质体形成与再生影响因子的研究① 1 1 1 2 2 李　平 , 张　强 , 宛晓春 , 陶文沂 , 丁霄霖 ( 1 安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点开放实验室, 合肥 230036; 2 江南大学) 摘　要: 运用正交试验设计研究酶系统、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂等因素对黑曲霉原生质体形 成与再生的影响, 确定黑曲霉原生质体形成与再生的最佳条件, 获得高产原生质体, 其浓度可达 30 ×106 个 mL , 再生率达 25% 以上。并于欧林巴斯相差显微镜下观察了黑曲霉原生质体的形成过程。 关键词: 黑曲霉; 原生质体形成与再生; 正交设计 　　中图分类号: T S201 3 文献标识码: A 文章编号: (2003) 1978 年原生质体融合作为一种新的基因重组手段于第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出, 1979 年Chang 和Cohen 首次报道了枯草杆菌种内的原生质体质粒DNA 高频转化, 随后原生质体技术被 广泛应用于各种研究之中, 如原生质体诱变, 原生质体的线粒体、病毒、外源DNA 等的引入, 原生质体 [ 1～ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] 固定化等 。本试验采用原生质体技术对菌株进行改良 , 根据正交试验法 对黑曲霉原生质体形成与 再生的影响因子进行探讨, 以提高菌株的产酶性能。首先对出发菌株黑曲霉进行酶解, 获得大量的原生 质体, 然后让其再生, 再经条件优化确定出原生质体形成与再生的最佳条件, 同时, 在相差显微镜下观 察了黑曲霉原生质体的形成过程。 1　材料和方法 11　材料 ( ) ( ) 菌种: 黑曲霉 A sp erg il lus n ig er , 江南大学 原无锡轻工大学 赠送。 培养基: PDA 斜面培养基, 菌丝生长培养基 (GM ) 和原生质体再生菌丝培养基 (RM ) [ 5 ]。 试剂: 纤维素酶、蜗牛酶由北京经科化学试剂公司生产, 溶菌酶由广东微生物研究所生产。 仪器: OL YM PU S 相差显微镜。 12　方法 6 菌丝培养: 取斜面上生长成熟的孢子, 用无菌水制成孢子悬液, 并调整孢子浓度至 4 ×10 以上, mL 取 03～ 05 mL 接种于表面覆盖有玻璃纸的GM 固体培养基上, 于 30 ℃培养 16～ 18 h 。 原生质体的分离: 用灭菌镊子轻轻揭下长有幼菌丝的玻璃纸, 于酶液中保温 2～ 3 h , 然后用高渗磷 酸缓冲液 ( 55) 稀释, 过 漏斗, 2 000 离心洗涤数次, 收集原生质体并计数。 pH G2 r m in