克隆原核和真核生物耐盐相关基因研究.PDFVIP

克隆原核及真核生物耐盐相关基因研究 摘 要 根据原核生物基因无内含子的特点 本实验参照大肠杆菌与耐盐性相关的甘 露醇-1-磷酸脱氢酶 mtlD 基因的保守序列设计一对引物 以极端嗜盐细菌假单 胞杆菌 Pseudomonas sp. cn 4902 的总DNA 为模板 通过 PCR 扩增出 mtlD 结 构基因 将该基因克隆至 pMD18-T 载体 测序结果表明 假单胞杆菌的 mtlD 结构 基因长 1149bp 编码 383 个氨基酸 本序列与多种生物的 mtlD 基因高度同源 库 与 E.coliK12 的 mtlD 基因的同源性高达 99% 将该结构基因与 pBV220 质粒构建 成大肠杆菌高效表达重组载体 pBH SDS电泳表明 含 pBH 的E.coli JM101 要 转化子产生特异的甘露醇-1-磷酸脱氢酶 分子量约为 41kDa 与预期相符 该酶 摘 具有较高的表达量 约占菌体可溶性蛋白 6.7% 后续实验表明 转化子的耐盐水 平比对照提高了约 22 % 此外 为了将该基因转入农作物中表达 本文尚构建了 文 植物双元表达重组质粒 pCH1301 并已成功转化农杆菌 Agrobacterium 论 rhizogenes EHA105 由于真核基因的不连续性 为了从中克隆与耐盐相关的基因 我们构建了可 士 耐受渗透压大幅变化 极端耐盐的巴氏杜氏藻 Dunaliella bardawil 的 cDNA 硕 文库 根据本实验室已有的 通过差别显示反转录 PCR DDRT-PCR 获得的 424bp 巴氏杜氏藻叶绿体 ATP 合成酶 -链基因片段 设计了两条引物 P1 博 5`CCAAGCTTCCCCAACTGG 3`和 P2 5`CAAGCTTCCGTGCGATACTC 3` 以pUC19 多克隆 学 位点两端的两个通用测序引物分别与 P 和 P 配合 直接利用双链 cDNA-pUC19 连 1 2 接物为 DNA 模板 经过两次 PCR 反应 扩增得到约 800bp 600bp 和 500bp 三条 大 特异 DNA 片段 通过回收 纯化 将上述片段分别克隆到 pMD18-T 载体上 目的 门 cDNA 片段的测序和拼接正在进行中 同时 经检测 本 cDNA 文库插入片段的大 小约为 1.1 2.3kb 重组率为 96% 其中原色菌斑的重组率达到了 90.9% 说明 厦 5 文库构建的质量高 文库约含重组质粒 2.36 10 个