第三章 蛋白质的修饰和表达.ppt

1 第三章 蛋白质的修饰和表达 第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达 第一节 蛋白质的化学修饰 一、蛋白质侧链基团的化学修饰 二、蛋白质位点的专一性修饰 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 四、蛋白质的化学交联和化学偶联 一、蛋白质侧链基团的化学修饰 修饰部位：蛋白质的侧链基团 （一）巯基的修饰 特点：亲核 最容易发生反应的侧链基团 修饰试剂 反应类型 烷基化试剂 羧甲基化 （碘乙酸、碘乙酰胺） N-乙基马来酰亚胺 光吸收 DTNB 二硫键、 有颜色的TNB （二、氨基的化学修饰） 特点：亲和反应活性高 赖氨酸的ε –氨基 修饰试剂 反应类型 TNBS 黄色复合物（420nm） 烷基化试剂 （卤代乙酸、芳基卤、芳族磺酸） 磷酸吡哆醛 光吸收 （三）羧基的化学修饰 由于羧基在水溶液中的化学性质使蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，最广泛，可在较温和的条件进行 （四）二硫键的化学修饰 修饰方法：还原 修饰试剂：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。 判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。 化学修饰影响条件 1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件； 2、pH值变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态； 3、温度：影响活性巯基的微环境 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。 二、蛋白质的位点专一性修饰 特点：试剂对被修饰基团、修饰部位具有专一性 类型 特点 应用 亲和标记 专一性标记酶活性部位 分离细胞表面受体 不可逆 光亲和标记 专一性标记酶活性部位 发现疾病相关的靶位点 不可逆 鉴别蛋白质 光反应基团 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 PEG特点：亲水、不带电荷 结合机制：共价结合，形成屏障保护抗原，阻止免疫反应和酶的水解 修饰方式：活化-OH（剧烈条件） 偶连基团：氨基、巯基、羧基 优点：延长半衰期、较小毒性、血药浓度波动小、酶降解作用降低…… 应用： 天门冬酰胺酶、腺苷脱氨酶 PEG 修饰脂质体包被的阿霉素 四、蛋白质的化学交联和化学偶联 交联：含有双功能基团的化学试剂与蛋白 质分子间形成网状交联。 第二节 蛋白质的分子生物学改造 基因突变 定点突变 定向进化 基因融合 （一）定点突变 定义：改变一个或两个碱基 特点：突变率高、简单易行、重复性好 方法：重叠延伸PCR技术、快速定点突变 应用：纤维蛋白酶原活化剂，降低血浆清除率，延长血浆半衰期 1、重叠延伸PCR技术 （二）定向进化（directed evolution） 范围：特定的蛋白质