Bax蛋白稳定高表达肝癌细胞的建立及其凋亡论文.docVIP

　　Bax蛋白稳定高表达肝癌细胞的建立及其凋亡论文 .freelechanism of proapoptotic gene bax in the apoptotic process of hepatocellular carcinoma（HCC），and to establish the HCC cells id of bacteriophague expression vector pBK-bax，an bax cDNA，ids of pBK-bax and empty vector pBK-CMV ethod.The positive cell clones，pty vec-tor，munocytochemical ABC method and image-quantitative analysis.The morphological changes of the cells ethod.RESULTS The agarose gel electrophoresis indicated that，there ent，pty vector，age-quantitative analysis after im-munocytochemical staining indicated that，there pty vector or untransfected HCC-9204cells.There orphological changes of apopto-sis，such as cell pyknosis，circled，densely stained and bub-bling，in some pBK-bax transfected cells，and its TUNEL in-dex pty vector or untransfected.CONCLU┐SION Bax gene could be transfected into HCC-9204cells successfully，and the HCC cells that can express Bax protein stably and highly could be obtained.The apoptotic rate of bax gene transfected HCC-9204cells increases significantly. 0 引言 Bax是目前细胞凋亡研究中较为热门的促凋亡基因，属于细胞凋亡相关基因bcl-2家族.在多数情况下转染bax基因不仅能够使细胞生长受到抑制，而且能够促进多种因素诱导的多种细胞的凋亡［1-4］ .关于转染bax基因对原发性肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡的影响及其作用机制尚未见报道.免疫细胞化学检测显示，HCC-9204是一株Bax蛋白表达相对较低的肝癌细胞系.我们用基因转染法把bax基因导入肝癌细胞系HCC-9204细胞中，建立稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞，并对其凋亡现象进行观察，为研究有关bax基因在肝癌细胞凋亡调控中的作用奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料 插有正向人bax cDNA（576bp）的pBK-bax噬菌粒表达载体菌种为本校免疫学教研室刘飞博士惠赠.pBK-CMV空载体质粒为上海第二医科大学司晓辉博士惠赠.人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立，用含有150mL L-1 新生牛血清的RPMI1640培养液在50mL L-1 CO2 条件下培养.INE和G-418为美国Gibco公司产品.鼠抗人Bax蛋白mAb为美国Oncogene公司产品.免疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法凋亡检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品. 1.2 方法 1.2.1 pBK-bax载体的鉴定 pBK-bax菌种经铺板活化后挑取单克隆菌株置于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振摇12h.用INE将pBK-bax质粒转染入HCC-9204细胞，同时设转染pBK-CMV空载体质粒和不转染的HCC-9204细胞对照.3d后换用含有500mg L-1 G-418的新鲜培养液继续培养，2～3L L-1 乙醇固定15min.分别经3mL L-1 H2 O2 和3mL L-1 Triton X-100处理后，加正常羊血清，37℃，30min.加鼠抗人Bax mAb，37℃，1h.加生物素化的羊抗鼠IgG mAb，37℃，30min.加ABC复合 物，37℃，30min.除加正常羊血清一步外，上述各步之间均用PBS洗.用新鲜配制的DAB显色10min.脱水，透明，封片;②图像分析:采用HPI