bcl2家族BH3only蛋白在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用论文.docVIP

　　bcl2家族BH3only蛋白在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用论文 谢奇朋，叶 艳，郝延璋，张旭东，张林杰 【摘要】 目的 研究bcl2家族BH3only蛋白Noxa、Bim和PUMA在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用。方法 Annexin VFITC染色，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率，半定量RTPCR检测细胞中BH3only蛋白的mRNA表达量。结果 依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂量、时间依赖性，SGC7901细胞系比BGC823更加敏感.freelRNA表达明显上调，Bim少量上调与依托泊苷诱导的细胞凋亡有关系；相反，PUMA的mRNA表达量在依托泊苷治疗前后没有变化。结论 依托泊苷诱导的胃腺癌细胞凋亡与BH3only蛋白Noxa和Bim表达上调有关联。 【关键词】 Noxa；Bim；PUMA；胃腺癌；细胞凋亡；依托泊苷 Key ；PUMA；Gastric adenocarcinoma；Apoptosis；Etoposide 胃癌是常见的恶性肿瘤之一。化疗药物依托泊苷（又名VP16、鬼臼乙叉甙）为细胞周期特异性抗肿瘤药物，依托泊苷可以与DNA拓扑异构酶II相互作用形成药物酶DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复，从而诱导细胞凋亡。BH3only蛋白是近年来研究比较热门的一类bcl2家族中具有凋亡启动作用的亚家族,包括Bim（bcl2 interacting mediator of cell death），Noxa（PMAIP1），Puma（p53 upregulated modulator of apoptosis），Bad，Bmf等，通过与bcl2/bax相互作用启动“内源性”凋亡途径，导致细胞凋亡。Noxa和PUMA主要受p53调节，细胞DNA损伤后通过p53可以上调Noxa和PUMA的表达［1］； Bim主要结合在微管动力蛋白上，受到细胞因子去除、Ca2+流出、紫外线照射、微管动摇和紫杉醇等刺激后可以转移到线粒体膜上［2］，从而发挥促凋亡活性。本研究使用依托泊苷作用胃腺癌细胞，检测BH3only蛋白的表达与细胞凋亡之间的关系，研究依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡的分子机制。 1 材料和方法 1.1 材料 依托泊苷购自沈阳科瑞斯德医药科技有限公司；SGC7901和BGC823胃腺癌细胞购自上海生命科学院细胞库，Annexin V 为caltag公司产品；TRIzol为Invitrogen公司产品；逆转录试剂盒为Promega公司产品；引物由上海生工生物工程公司合成。 1.2 主要实验仪器 流式细胞仪型号为FACScalibur；PCR仪为MJ RESEARCH .INC公司的PTC100；凝胶成像系统为黑马公司产品；电泳仪为北京六一仪器厂产品。 1.3 细胞培养及药物配制 SGC7901和BGC823细胞接种于含有10%小牛血清（FCS）、1%双抗、1%L谷胺酰胺的DEME培养液中，在37℃，CO2浓度为5%的培养箱中生长，每2～3d传代一次。依托泊苷用DMEM培养液配制成10 000μM贮存液，在－20℃中保存，临用前稀释成所需浓度。 1.4 流式细胞术 用酶消化法收集不同浓度依托泊苷诱导各个时点的细胞，冰冷PBS洗涤两遍，binding buffer重悬细胞，调整细胞密度为5×105/ml，取195μl细胞悬液加5μl Annexin V混匀避光作用30min。流式细胞仪在488nm激发波长处进行检测，实验重复3次，取平均值，结果用DI2.8软件分析。 1.5 RNA提取及质量鉴定 按TRIzol说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计鉴定样品的纯度和浓度。测得的A260/A280均在1.8～2.0之间，RNA电泳可见清晰的28S、18S和5S三条带，RNA用PCR扩增GAPDH无产物，表明所提取的RNA中没有DNA污染。 1.6 半定量RTPCR 逆转录按照Promega逆转录试剂盒说明操作，各个标本调整到同一浓度再进行逆转录。内参照为GAPDH，引物：GAPDH（580bp）上游：AATCCCATCACCA TCTTCCA，下游：CCTGCTTCACCACCTTCTTG，Noxa（196），上游：AGATGC CTGGGAAGAAG，下游：AGTCCCCTCATGCAAGT，Bim（204bp），上游：GCCCCT ACCTCCCTACAGAC，下游：ATGGTGGTGGCCATACAAAT，Puma（212bp），上游：GCCCAGACTGTGAATCCTGT，下游：TCCTCCCTCTTCCGAGATTT，PCR的反应程序为：94℃ 5min后进入循环，每循环为94℃ 30s，55℃ 30s 72℃ 30s，32个