CD59基因的突变并真核表达载体的构建论文.docVIP

　　CD59基因的突变并真核表达载体的构建论文 朱新红 高美华 任书荣 王秋波 王静 林存智 【摘要】 目的 构建两种活性位点相关性CD59突变基因，并重组入真核表达载体。方法 选取物种间高度保守D18TVector, EcoRⅠ单酶切获得目的基因，重组入真核表达载体pIRES。结果 通过PCR定点诱变成功获得两种目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRESm1CD59、pIRESm2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500 bp。结论 重叠延伸 PCR法诱变经济可靠，重组质粒的构建为进一步研究CD59的抗补体活性奠定了基础。 【关键词】 抗原 CD59 点突变 真核表达 ［ABSTRACT］ Objective To construct tutagenesis and clone mutants into eukaryotic expression system. Methods The highly conserved utant CD59 DNAs ed by sequence analysis. Rebinant plasmids of pIRESm1CD59 and pIRESm2 CD59 e digestion analysis. The mutant gene ical and in reliable, and the rebinants ent activity. ［KEY D18Tvector, EcoRⅠ内切酶, T4 DNA连接酶, Marker DL2000购自Takara(Japan), Taq DNA聚合酶购自Promega(Madison, 109由本室保存。 1.2 主要仪器和设备 高速低温冷冻离心机（日本KUBOTA公司）,CO2孵箱（美国Thermo Forma公司）,倒置相差显微镜、万能荧光显微镜（日本Olympus公司）,PCR扩增仪（美国MJ Research INC公司）,核酸蛋白分析仪（美国Eppendorf BIO Photometer公司）。 1.3 方法 1.3.1 突变部位的选择 通过对比各物种CD59的氨基酸序列，发现R结构显示其活性位点位于疏水性沟槽内，1F、M1R）带有诱变位点，中部缺失TGG共３个碱基（TGG编码2F、M2R为突变m2CD59的引物，中间部位有9个碱基的突变，是将TGTTGGAAG突变为TGGTGGTGG的替换突变。引物由上海生工公司合成。见表1。 表1 突变CD59基因引物设计（略） 1.3.3 目的基因的获得及纯化 以CD59 cDNA为模板，上述引物经重叠延伸PCR三重聚合酶链反应扩增获得目的基因。PCR1:引物为pT7、M1R,反应参数:94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s,42 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共25个循环；72 ℃延伸7 min。 PCR1扩增前半段CD59。PCR2:引物为M1F和T3,反应参数同PCR1。PCR2扩增后半段CD59,与PCR1产物有27碱基重叠（为引物部分扩增产物）。PCR3:将纯化的PCR1和PCR2扩增产物等摩尔混合为模板,pT7和T3为引物,94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s,46 ℃45 s,72 ℃ 45 s,共25个循环；72 ℃延伸7 min。扩增获得完整的含诱变位点的m1CD59目的基因片段。m2CD59的扩增条件相同，引物不同，PCR1的引物为pT7、M2R, PCR2的引物为M2F、T3, PCR3的引物为pT7和T3。10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。 1.3.4 克隆载体构建 PMD18TVector载体长2 692 bp,含有氨苄青霉素抗性基因，可与PCR扩增产物直接连接。扩增出的m1CD59、m2CD59经纯化后, 用T4DNA连接酶与PMD18TVector载体16 ℃过夜连接,连接产物用CaCl2法转化JM109大肠杆菌,氨苄青霉素筛选。 1.3.5 阳性重组克隆的鉴定 PCR反应体系25 μL，其中含有转化重组质粒的E.coli JM109 菌液（模板）2 μL,10×buffer 2.5 μL,dNTP 0.2 mmol/L,Taq DNA 聚合酶 0.3 μL (1.5 U),以PT7和M1R (或M2R) 0.25 μmol/L 为引物，热启动变性94 ℃10 min,20循环(94 ℃ 30 s,45 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s),15循环(94 ℃ 30 s,46 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s), 72℃延伸7 min。将证实后的阳性克隆在LB培养基(含Amp)中大量扩增,