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　　人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定论文 蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊.freelan H4 gene rebinant adenovirus 【Abstract】 AIM: To construct the rebinant adenovirus of human H4 gene. METHODS: H4 gene fragment id pAdTrackCMV to form the transfer vector by the methods of homogeneous rebination in bacteria and the rebinant adenovirus ine 2000. The target gene erase chain reaction (PCR) and the titer and its infection rate ined using the green fluorescent protein (GFP) expression in the shuttle plasmid. RESULTS: Restriction enzyme digestion analysis and the sequence analysis confirmed that the H4 gene icroscope. CONCLUSION: The rebinant adenovirus containing human H4 gene is successfully constructed by the method of homogeneous rebination in bacteria. 【KeyRNA的80%［5］. 最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在H4 D553N或1613delC位点突变［6,7］. 为了进一步深入研究H4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达H4的重组腺病毒载体. 1材料和方法 1．1材料 腺病毒细菌内同源重组系统包括E.coli Bj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdeasy1（美国Johns Hopkins大学Dr. He TC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（Gibco BRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（Hispeed Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司）；氯化铯（Sigma公司）. 其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂. 1．2方法 1．2．1穿梭载体pAdTrackCMV H4的构建和鉴定 1．2．1．1pAdTrackCMVH4的构建质粒pcDNA3.1H4用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收4.7 kb的H片段. 穿梭质粒pTrackCMV用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收载体骨架，T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的基因片段得到重组质粒pTrackCMVH4. 转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒提取质粒. 1．2．1．2pAdTrackCMVH4的酶切鉴定取0.5 mL离心管，依次加入酶切缓冲液2 μL，内切酶HindⅢ 0.5 μL，内切酶XbaⅠ 0.5 μL, 重组质粒0.5 μL，去离子水16.5 μL，充分混匀，37℃水浴2 h，酶切后10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带. 1．2．2细菌内同源重组产生腺病毒质粒用100 mL/L的冰冷的无菌甘油制备E.coli BJ 5183及E.coli DH5α电穿孔感受态菌，将穿梭质粒pAdTrackCMVH4用PmeⅠ线性化，纯化回收酶切产物. 分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy1等浓度比混合，在2500 V, 200 Ω, 25 μF条件下，电转化BJ5183感受态菌，卡那霉素（50 mg/L）固体LB培养基筛选，16 h后挑取10个克隆，提取质粒. PacⅠ酶切鉴定阳性克隆得到重组腺病毒质粒pAdH4. 重组腺病毒质粒pAdH4的序列测定： 以质粒提取试剂盒提取的高纯度质粒为模板，双脱氧核苷酸终止法测序，以SP6Promter Primer为测序引物，采用ABI PRISM B DyeTM测序试剂盒在ABI PRISMTM377XL DNA sequncer序列分析仪上对插入片段进行序列测定. 1．2．3293细胞中包装产生重组腺病毒利用HEK293细胞可稳定表达复制缺陷病毒Ad5 E1基因的特性，将重组病毒质粒包装成有完整功能的重组