人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立论文.docVIP

　　人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立论文 杨俊霞 石华 魏丽丽 袁成福 陈济 易发平 马永平 宋方洲 【关键词】 MCHR2；真核表达载体；转染；基因表达 【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human melaninconcentrating hormone receptor 2 (MCHR2) and stably transfect HEK293 cells ent plified by PCR from the human fetal brain cDNA library and id ine. After screening culture by G418, a stablytransfected cell line munofluorescence assay. RESULTS: The eukaryotic expression vector pcDNA3.1MCHR2 ent of the stablytransfected cell line and the expression of the target gene provide a solid experimental foundation for further studies on the function of the MCHR2 gene. 【Keyelaninconcentrating hormone, MCH)进入人们的视野. 现已发现其有2种受体亚型，即MCHR1和MCHR2均属于G蛋白偶联受体家族. 通过构建转基因和基因敲除动物模型已对MCH及MCHR1与肥胖及能量代谢的关系进行了深入细致的研究，但有关MCHR2的功能至今仍不十分清楚. 为此我们构建了人MCHR2基因的真核表达载体，并转染HEK293细胞，建立了稳定表达MCHR2的细胞系，为深入研究MCHR2的生物学功能奠定实验基础. 1材料和方法 1.1材料人胎脑cDNA文库购自Clontech公司. 菌株E. coli DH5α，质粒pcDNA3.1(+)和HEK293细胞由本教研室保存. RTPCR试剂盒(TOYOBO公司)；Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶(EcoR I，Xho I)等工具酶(TaKaRa公司)；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(Qiagen公司)；脂质体LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)；G418 (Amresco公司)；总RNA抽提液TriPure (Roche公司)；MCHR2抗体(Santa Cruz公司);HRP标记的兔抗羊IgG和FITC标记的兔抗羊IgG(北京鼎国生物技术有限公司). 1.2方法 1.2.1引物设计与合成根据GenBank登录的人MCHR2基因的序列（序列号为：AY562946）设计引物. 上游引物为：5′ccggaattcACCATGAATCCATTTCATGCATCTTG3′；下游引物为：5′ccgctcgagATGGTGATCCATGTACTTTCCTAA3′. 其中分别在上游和下游引物的5′端加上了EcoR I和Xho I的酶切位点和3个保护碱基，并且在起始密码前添加了Kozak序列，引物由TaKaRa公司合成. 1.2.2人MCHR2全长cDNA的获取以人胎脑cDNA文库为模板，采用PCR的方式扩增人MCHR2 cDNA的编码区，全长为1023 bp. PCR 50 μL 反应体系中加入cDNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL，20 μmol/L上下游引物各1 μL,，Taq酶0.5 μL ，加水至50 μL. 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 60 s，57℃ 50 s，72℃ 70 s，35个循环；72℃ 7 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定. 1.2.3人MCHR2真核表达载体的构建将上述PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4 DNA连接酶连接后转化E. coli DH5α感受态，氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，阳性克隆的质粒DNA经测序分析后证实并命名为pcDNA3.1MCHR2. 1.2.4建立稳定转染人MCHR2的HEK293细胞系HEK293细胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，50 mL/L CO2的饱和湿度下培养. 待细胞融合至70%~80