人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析论文.docVIP

　　人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析论文 .freelan Embryonic AGM-Derived Stromal Cells Abstract To screen and separate the genes differentially expressed in human embryonic aorta-gonad-mesonephros(AGM)-derived stromal cells，a subtracted library an embryonic AGM-derived stromal cells as target and human fetal liver(FL)-derived stromal cells as drivers. Then a high though screening technique，gene chip，ately 18 of the resulting subtracted cDNA clones the established subtractive library，the positive ratio ount to 76.4%. 18 over-expressed genes ore than a 5-fold difference expression levels betal cells，and ong the sequenced clones，14 sequences igration，cell differentiation，cell proliferation，cell cycle，signal transduction，and angiogenesis. Most of these genes have not been reported to relate to the haematogenesis in ontogeny. It is concluded that many genes both knoan embryonic aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells. Discovery of these genes provides a solid foundation to elucidate the mechanism of haematogenesis in ontogeny. Key al cell； suppression subtractive hybridization; gene chip 主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros，AGM）区近年来被认为是永久造血干细胞（definitive HSC）出现的最早区域，为胚胎造血发生提供了必要的启始条件［1］，正成为国际上造血分化机理研究中的热点［2，3］，但其具体的分子机制仍不清楚。本研究建立了人AGM及胎肝（fetal liver，FL）基质细胞的抑制消减杂交文库，为阐明胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供线索。 材料和方法 主要试剂 IMDM培养基及胎牛血清均购自Gibco公司。总RNA提取试剂TRIZOL购自上海生工公司。mRNA分离试剂盒-Oligotex mRNA kit购自德国Qiagen公司，抑制消减杂交试剂盒PCR-Select TM cDNA subtraction kit购自购自美国Clontech公司。A-T clone试剂盒InsT/AcloneTM PCR product kit购自立陶宛Fermentas公司。大肠杆菌JM109购自大连TaKaRa Biotech公司。 基质细胞 按照本室方法建立的人AGM区基质细胞（hAGMS3）［4］，在含15%的胎牛血清的IMDM中传至第6代，用于实验；人胎肝基质细胞取自因意外致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织，用胰蛋白酶消化法获得基质细胞，传至第6代用于实验。 AGM及FL基质细胞的鉴定 采用流式细胞仪检测细胞膜表面分子CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD105的表达。 AGM基质细胞抑制消减杂交文库的建立 利用Clontech公司PCR-SelectTM cDNA subtraction kits，以FL基质细胞细胞作为“驱动方（driver）”，AGM基质细胞作为“实验方（tester）”进行抑制消减杂交，将两次消减杂交的产物经过两轮PCR反应扩增后，利用Fermentas IinsT/AcloneTM PCR product kit将其克隆到PUC57/T 载体，经过蓝白斑筛选，挑选白色菌落（阳性克隆）即获得HL-60/DNR抑制消减杂交文库。 抑制消减杂交文库的基因芯片筛选