食品酶学课件本(第三章酶的分离纯化第四节分离方法2).pptVIP

* * （四）亲和层析 1、原理：利用生物大分子与配基之间所具有的专一又可逆的结合，将配基共价连接在固相载体（基质）上，通过层析柱的生物大分子就能以其高亲和力与配基特异结合，与其它杂质分离而达到纯化目的。 亲和层析是从复杂混合物中纯化蛋白质的最好的方法。 2、亲和层析基质和配体： 3、基质与配体偶联： 4、亲和层析操作步骤： 5、亲和层析的应用： ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? （ 制作：赵效国 * * 1、亲和层析的原理 制作：赵效国 * * 2、亲和层析基质和配体 理想的基质应满足的条件： （1）能构成松散的多孔网络；（2） 极低的非特异性吸附； （3） 高度的亲水性； （4） 较好的理化稳定性； （5）具有大量能活化并与配基结合的基团。 可供选择的亲和层析基质：琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素等。以4%的交联琼脂糖（Sepharose 4B）最为常见。 亲和层析配体的条件： （1）与纯化的物质有较强的亲和力；（2）具有与基质共价结合的基团。如：底物、底物类似物、别构酶的效应因子、辅因子、抑制剂、抗体、染料等。 制作：赵效国 * * 亲和层析的几个名词 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液（流动相）中的另一方分子进行亲和层析。例如，酶与其辅酶是分子对，既可把辅酶作为固定相，对样品液中的酶进行亲和层析分离；也可把酶作为固定相，使样品液中的辅酶分离纯化。在亲和层析中，作为固定相的一方称为配体（配基）。 配基必须偶联于不溶性母体上。母体又称载体或担体或基质，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等作为母体。 活化后的不溶性母体已有商品出售，商品名为偶联凝胶。 制作：赵效国 * * 3、基质和配体的偶联 基质的活化： CNBr法：作用于葡聚糖或琼脂糖的羟基上，形成活泼的亚氨基碳酸盐衍生物。 引入连接（手）臂： 通过直接偶联的方式得到的亲和吸附剂，基质和配基间距离较近，形成空间位阻，难于进行亲和作用。通常在基质与配体间引入适当长度的连接臂。使配基能自由伸入溶液而增进对酶分子的吸附效率。常用的连接臂为二胺化合物。图例 偶联：一般在活化后快速进行。 OH OH CNBr O O C=NH pH11 制作：赵效国 * * 亲和层析连接臂的作用 制作：赵效国 * * 4、亲和层析操作步骤 （1）制备亲和层析剂 ①选配基 ②选偶联凝胶 ③偶联 例 （2）装柱层析 亲和层析剂制备好后，装进层析柱。当酶液流经亲和层析柱时，酶与其配基结合，留在柱内，而其他杂质不与配基结合，可洗涤流出。 （3）洗脱 用洗脱液将酶洗脱出来，达到分离纯化。洗脱时要选择好洗脱剂及洗脱条件，使原已亲和吸附在配基上的酶不受损害地洗脱下来。洗脱过程中酶与配基的亲和力降低而解吸。例 注意事项：在酶的亲和层析过程中，为了防止酶变性失活，并使亲和层析剂免受损害，一般应在低温（0～10℃）的条件下进行操作。 制作：赵效国 * * 制备亲和层析剂实例 在酶的亲和层析分离纯化中，大多数采用琼脂糖凝胶为母体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。例如，以细菌细胞壁的水解产物为配基，偶联于琼脂糖凝胶上，用于溶菌酶的分离纯化；用环状糊精作为配基，以环氧化物活化的琼脂糖凝胶为母体制成亲和层析剂，用于分离纯化α-淀粉酶；以辅酶Ⅰ为配基，制成亲和层析剂，可用于以辅酶Ⅰ为辅酶的酶的纯化，如乳酸脱氢酶。 制作：赵效国 * * 亲和层析洗脱举例 以卵类粘蛋白为配基，在pH7～8的条件下，胰蛋白酶与配基亲和吸附，而以pH2～3的缓冲液可将胰蛋白酶洗脱出来 。 制作：赵效国 * * 5、亲和层析的应用 纯化大分子物质： 酶的纯化、糖蛋白的纯化（以凝集素做配体）、抗体纯化（以抗原做配体） 研究酶的结构与功能。 将有生物活性的蛋白和失去活性的蛋白分开，也可进行活力检测。 制作：赵效国 * 吸附层析：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。 分配层析：是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。 * 不同蛋白质由于其pI不同，在同一pH值介质中的电离状况亦不同，分子所带电荷的种类和数量就不同，与离子交换剂的静电吸附能力亦不同。通过上样吸附和改变离子强度或pH解吸洗脱，可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开。 例如：溶菌酶，pI=10，对酸不敏感，可选用弱酸性的阳离子交换剂。 * 不同蛋白质由于其pI不同，在同一pH值介质中的电离状况亦不同，分子所带电荷的