OXA50型碳青霉烯酶基因在铜绿假单胞菌中分布的初步研究论文.docVIP

　　OXA50型碳青霉烯酶基因在铜绿假单胞菌中分布的初步研究论文 刘梅 杜宝中 曾蔚 程曦 陶传敏 康梅 贾文祥 【摘要】 目的 研究铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制。方法 收集非重复34株铜绿假单胞菌临床株，PCR扩增blaOXA50基因、测序、在GenBank上比对、提取质粒DNA、对该基因进行PCR扩增。结果 PCR检测出34株铜绿假单胞菌中有15株含OXA50型基因，其中30株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中有12株阳性，4株敏感菌中亦有3株阳性；随机选取1株阳性菌PCR产物送测序，测序结果在GenBank上进行blast比对，显示有两个突变点；blaOXA50基因扩增阳性的15株铜绿假单胞菌，提取质粒DNA扩增该基因.freelonas aeruginosa. Methods A total of 34 isolated clinical strains of Pseudomonas aeruginosa ers specific for blaOXA50, id DNA of positive strains for PCR sresistant Pseudomonas aeruginosas, and 3 strains ssensitive Pseudomonas aeruginosa; the sequencing result of one positive strain shoutational sites, and the PCR for plasmid DNA of all positive strains ent, the detection rate of blaOXA50 utational sites in one of positive strains, and all the blaOXA50 osome. KEY icroScan P)、环丙沙星(ciprofloxacin，CPLX)、头孢他啶(ceftazidime，CAZ)、哌拉西林(piperacillin，PIPC)和阿米卡星(amikacin，AMK)；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京天为时代公司；PCR相关试剂购自广州东盛生物科技有限公司。 1.2 药物敏感实验 采用MicroScan快速接种法，直接挑取菌落充分混匀于生理盐水，倾注于配套Negative boPanel Type21鉴定药敏板(NC21测试板)，进行体外药敏测定，实验中每批次的鉴定药敏板均用大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853进行质控。同时采用CLSI/NCCLS推荐的琼脂对倍稀释法进行5种药物各15个浓度的体外药敏测定MIC值，以铜绿假单胞菌ATCC27853进行质控，按照CLSL/NCCLS(2004年)规定判断结果。 1.3 细菌DNA的提取 采用北京天为时代公司的细菌基因组DNA提取试剂盒制备细菌模板DNA，提取的DNA经A260/A280测定符合质量标准，置-20℃冰箱保存待用。 1.4 blaOXA50基因的PCR扩增和序列分析 blaOXA50基因扩增引物参照Girlich等［8］的报道，由上海英骏生物技术有限公司合成，上游引物S(5′AATCCGGCGCTCATCCATC3′)，下游引物AS(5′GGTCGGCGACTGAGGCGG3′)，预期PCR产物大小为869bp片段，涵盖了blaOXA50基因编码序列。PCR反应采用降落PCR，反应条件：预变性94℃ 5min；变性温度94℃ 1min，退火温度65℃ 1min，延伸温度72℃ 1min，两个循环；变性温度94℃ 1min，退火温度64℃ 1min，延伸温度72℃ 1min，两个循环；以此类推，退火温度每降低一度，进行两个循环，当退火温度降到55℃时，循环数变为10个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果在凝胶成像系统下观察，并拍照保存。随机选取一阳性PCR产物送英骏公司测序。 1.5 细菌质粒DNA的提取及blaOXA50基因的PCR扩增 将细菌基因组DNA PCR扩增阳性的菌株进行质粒DNA提取，采用北京天为时代公司的质粒小量提取试剂盒；然后用相同的引物以及PCR条件进行扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果在凝胶成像系统下观察，并拍照保存。 2 结果 2.1 药物敏感实验 34株铜绿假单胞菌对IMP、CAZ、CPLX、PIPC和AMK五种抗生素的耐药情况见表1。 2.2 blaOXA50基因的PCR扩增和序列分析 (1)PCR扩增 以特异引物S和AS扩