实时定量PCR技术在油菜菌核病菌对多菌灵抗药性监测中的应用研究.pdfVIP

实时定量PCR技术在油菜菌核病菌对多菌灵 抗药性监测中的应用研究 赵 伟 陈长军 王建新 周明国. (南京农业大学植物保护学院，南京 210095) 摘要:油菜菌核病是我国油菜主要产区的重要病害，严重影响着油菜生产，目前防治菌核病的药剂主要是 以多菌灵为主的苯并味哇类杀菌剂。苯并咪哇类杀菌剂主要通过与病原菌P-微管蛋白结合，抑制微管的功 能，阻止细胞的有丝分裂，抑制病原菌生长。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率 高，一般使用2一3年后许多病原菌很快会出现杭药性问题。现有研究证明，卜微管蛋白198位氨基酸由谷 氨酸 (嘶)突变为丙氨酸 (Ala)是导致核盘菌 [Sclerotiniaaderotionurz(lib)deBar3」产生对多菌灵田间 抗药性的主要原因。 为了快速、准确检测和监侧S..rclaottoran.的田间抗药性菌株频率，根据”丑Cm菌株的点突变设计了2 种实时定量PCB检测方法:第一种方法利用两条两端分别标记了不同发光基团的T.F,- 荧光探针可以与各 自模板特异性结合发出不同荧光的原理来定量敏感和抗性核盘菌的数量;第二种方法在ASO-PCB检测技术 的基础上结合了SYRRGREENI荧光染料可以与双链DNA结合发光的原理实现了对抗性核盘菌和全体样本 的实时定量检测a 在Ta(n-荧光探针实时定量PCR方法的研究中，设计了一对可以扩增出包含突变位点片段的通用引物 TYF,TYR和敏感探针 (5端发光基团标记为Rox,3端淬灭基团为Terms)及抗性探针 (5端发光基团标 记为Fam,3端淬灭基团为Tame)，以期能在同一个反应管中同时获得敏感病原菌总数和抗药性病原菌总 数等数据。实验中对反应体系进行了反复优化，未能实现同时检测;并且抗性探针的特异性较差，不能保 证与抗性模板的特异性结合，因此TagMan荧光探针多重定量PCR技术不适用于油菜菌核病菌对多菌灵抗 药性突变这一单碱基的点突变类型的检测。 在SYBRGREEN工荧光染料实时定量PCR方法的研究中，根据ASO-PCR检测的原理用198位突变密码 子作为3末端碱基设计了1对引物RFP4,RRl，来扩增产生突变的抗性核盘菌户微管蛋白基因片段，根据 S.aderotionmtP.微管蛋白基因内含子与其他常见丝状真菌的差异设计了特异性引物S,LSF,Sc1AF来扩增核盘 菌的特异性片段，这样通过这两对引物的特异性保证了检测的可靠性和准确性;在定量方法上，选用SYRR GREEN工荧光染料使检测灵敏度大为提高，可以检m出。0028ng(3.17x10eg3y)的模板含量，是普通 ASO-P4】方法的十倍以上;采用从菌核直接提取基因组DNA的方法，并且不需要对每个菌株单独处理，大 大节省了检侧时间和工作量，该方法从基因组的提取到定量PCR检测的结束，整个过程仅需要4ha 通过，BRGREENI荧光染料实时定量PCR法建立了油莱菌核病菌对多菌灵田间抗药性检测的定量标 准曲线方程。抗药性菌株的定量标准曲线方程为:Y二一3.458+25.60 护二。.998;菌核菌总量的定量标 准曲线方程为:Y二一3.41X+27.30 护二。.999(Y表示Q值，X表示模板质量对数)。根据以上方程对 2002年采集自江苏省通州市4个乡镇田块的核盘菌200个菌株进行了测定，结果表明 (36.83:0.09)%的菌 株对多菌灵具有抗药性。这一结果与采用传统菌落直径法测得的结果 (223个菌株，35，9%)和普通A，) PCR检测的结果 (100个菌株，39%)相吻合。 关键词:油菜菌核病孟多菌灵:抗药性:点突变;实时定量PCR 作者简介:赵伟 (1980一 》，男，硕士生，从事杀菌剂毒理及抗药性研究;*通讯作者:周明国 (1954一 )， 男，江苏南通人，教授，博士生导师，主要从事植物病害化学防治研究，meil:mphmOnjm.eud.m, 江苏省科技攻关项目:项目编号BE2006304, 180 中国植物病害化学防治研究 第‘五卷) UsingReal-timePCRTechniquesforDetectionof Carbendazim Resistance inSclerotiniasclerotiorum