异体树突状细胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效应实验论文.docVIP

　　异体树突状细胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效应实验论文 【摘要】 探讨大鼠异体树突状细胞融合瘤苗诱导的抗骨肉瘤免疫学效应。 方法 采用R106通过电穿孔的方法进行融合。经分离纯化后，分别与SD、TT法测定细胞毒T淋巴杀瘤活性。结果 T淋巴细胞和异体融合瘤苗经过共同培养，T细胞得以显著增殖。异体瘤苗诱导的UMR106特异性CTLs杀瘤效果显著，该效应是由MHCⅠ限制的CD8+细胞发挥作用。结论 异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗具有显著的刺激T淋巴细胞增殖和诱导特异性CTLs的潜能，为以树突状细胞为基础的免疫治疗领域提供了新的策略，有望在临床骨肉瘤患者中获得广阔的应用前景。 【关键词】 树突状细胞 骨肉瘤 融合瘤苗 免疫治疗 0 引 言 瘤苗作为肿瘤特异性主动免疫治疗方式，目的是激发启动、调节增强机体固有的免疫功能和抗癌能力以维护机体生理平衡。它具有使机体由被动抗癌向主动抗癌转变的特点。目前瘤苗制备中抗原负载的方法种类繁多.freelerican Tissue Culture Collection）。 1.2 主要仪器和试剂 MiniMACS磁性分离仪为德国Miltenyi Biotec GmbH公司产品；流式细胞仪为美国BD Phar Mingen公司产品；细胞融合仪为美国BTX公司的2001型产品；酶联免疫分析仪为芬兰Labsystem公司产品；rGMCSF、rIL4、rTNFα购自R＆D公司；FITC标记抗大鼠MHCⅠ、MHCⅡ、FITC标记抗大鼠CD4、CD8、FITC标记抗大鼠CD44、PE标记抗大鼠OX62、PE标记抗大鼠CD80、CD86购自英国Serotec公司；小牛血清和RPMI1640培养基为美国HyClone公司产品；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司。 1.3 细胞培养与融合 1.3.1 I1640，将其针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓直至骨变白，收入50ml离心管中，1 500r/min离心收集骨髓细胞，弃上清，沉淀细胞用5ml 无血清RPMI1640重悬，再经淋巴细胞分离液密度梯度离心，初步纯化单个核细胞(Bone marroononuclear cells，BMMCs)，离心洗涤2次，收集沉淀的骨髓细胞。 1.3.2 DCs的培养扩增及鉴定方法 见文献4。 1.3.3 骨肉瘤细胞的培养和融合 SD大鼠骨肉瘤细胞系UMR106培养在含100mol/L的小牛血清的RPMI1640培养液中，呈单层生长。分别收集培养的DCs和骨肉瘤细胞，用细胞融合仪融合，操作按说明书进行。 1.3.4 DOF的筛选 经过融合的细胞在培养瓶中生长24h后，弃去悬浮的细胞，收集贴壁生长的细胞。应用标记抗大鼠OX62单抗免疫磁珠MiniMACS分离柱筛选，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时，去除膜表面不表达OX62的细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集OX62＋细胞，去除其中未融合的肿瘤细胞，具体操作按说明书进行。 1.3.5 DOF的表型检测 DOF培养扩增后，采用双色荧光标记流式细胞术测定DOF表面antirat CD44（FITC）和antirat OX62（PE）的表达水平。1×106个DOF悬液用PBS洗涤2遍，采用FITC标记抗大鼠CD44染色30min，再用PBS洗涤1次，然后用PE标记抗大鼠OX62染色30min。用PBS洗涤1遍后，制成1×109个/ml浓度的细胞悬液，采用流式细胞仪进行检测。 1.4 DOF诱导的T淋巴细胞增殖效应及其亚群分析 1.4.1 T淋巴细胞的制备 按照培养DCs的方法制备SD或MCs，采用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。将尼龙毛柱高压灭菌，以温PBS洗柱，将柱内气泡排出，置37℃、5%CO2孵箱1h。然后将BMMCs细胞悬液加至柱的上端，待柱内PBS被完全排出时，关闭下端口，再放入孵箱中60min。用温PBS洗柱，收集洗脱液，得到富含T细胞的细胞悬液。用完全RPMI1640液、含rhIL2（100u/ml）的完全RPMI1640培养基将T细胞调整为2×106/ml， 于37℃、5%CO2、100%湿度条件孵箱培养3天，期间半量换液1次，培养液成分同前。 1.4.2 以DOF作为刺激细胞（分别将未经融合处理的DCs和UMR106作为对照），经60Co（30Gy）照射灭活，分别以空白/孔、1×103/孔、5×103/孔、2×104/孔接种于96孔培养板，每组设3个复孔，每孔再加入1×105个SD或TT溶液，使其终浓度为2g/L，继续孵育4h，终止培养；离心（1 000r/min，5min）后弃去上清，加入DMSO 150μl/孔，震荡10min；酶联免疫分析仪于波长490nm处检测OD值，结果以3孔均值表示。刺激指数（St