液相色谱仪实用技术—培训课件.pptVIP

色谱柱的使用及保养 色谱柱与仪器的联接 ?不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时,会造成：色谱峰展宽(死体积)致使柱效下降或渗漏 解决办法∶ ? 自制相应的转换接头 ? 使用“通用”型接头（锥箍及螺母） 这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth的长度可调，能换接不同的色谱系统及色谱柱。如PEEK工程塑料的接头 色谱柱与仪器的联接 ?各种锥箍和管路接头长度示意图图: 色谱柱与仪器的联接 ? Stop_depth长度不合适造成柱前死体积 锥箍 色谱柱与仪器的联接 ?锥箍锥度不合适造成渗漏: 测柱效-良好的色谱实验习惯 ? 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 ? 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录 ? 色谱测试条件 ? 定期检测柱效 ? 定期检测仪器的谱带展宽 测柱效的方法 ?色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 ? 各色谱柱均附有说明书,可按说明书所述方法测定 例：Waters反相C18柱的测定方法 ? 流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min ? 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈, ? 加入600μl丙酮 ? 进样量5μl ? 检测波长:254nm 计算色谱柱的柱效 N 理论塔板数计算公式： W σ 方法 Wtan 16 切线法 Wh 5.54 半峰高 W3σ 9 3σ W4σ 16 4σ W5σ 25 5σ 不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来 色谱柱的正确使用及操作 ? 流动相的转换 ? 流速(压力)的变化幅度 ? 温度的变化幅度 ? 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求 记住∶拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！ 正确使用色谱柱（一） ?样品方面 ?除去微粒及杂质 ?了解样品在流动相中的溶解度 ?如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 ?了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用 正确使用色谱柱（二） ? 流动相方面 ?除去微粒 ?纯度的要求 ?超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 ?缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 ?缓冲液（盐）的浓度 ?溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 ?溶剂中的杂质含量 ?流动相对样品的溶解度 ? 有机溶剂或水的比例 色谱柱的在线保护装置 ?给色谱柱提供物理的保护 ?除去样品及流动相中的颗粒 ?给色谱柱提供化学的保护 ?防止分析柱被化学污染 ?装置 ?在线过滤器 ?自装填料保护柱 ?预装保护柱 在线过滤器 ?防止颗粒在色谱柱头累积 ?优点：基本不影响柱效 ?在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析） 可更换的消耗品 ?更换滤芯 ?更换垫圈 保护柱 ?可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 ? 保护柱的种类 ? 普通自装填料的保护柱 影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大 ? 有各种填料的预装柱供选择，使用方便 填料容积较小，会引起柱效降低 色谱柱的清洗 ?对所做的样品要有充分的了解 ? 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 ?硅胶柱的一般方法 ? 先用甲醇洗去极性杂质 ? 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化 ?键合相柱(烷基)的一般方法 ? 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 记住∶每种色谱柱可能有特定的方法一定 要先看其使用说明！ 反相C18色谱柱的清洗 在流动相中添加了一些酸、碱或缓冲盐后一般的冲洗方法： 第一步：用和流动相相同比例的水和有机相冲洗 第二步：增大水的比例到90%~95%（最好用梯度） 第三步：增大有机相比例到100%（最好用梯度） 最后保存在有机相（甲醇或乙腈）中 色谱柱的存放 ?存放前的处理 ?除去杂质、缓冲盐 ?合适的存放溶剂 ? 避免色谱柱床的干涸 ? 避免机械震动 ? 防止细菌生长 ? 注意存放的温度 柱效低--柱内因素 ?色谱柱被污染 ?过滤片部分堵塞 ? 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 ?色谱柱内的死体积 ? 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 ? 流速急剧变化造成固定相物理损坏 ? 机械震动造成柱床产生裂缝 ? 柱床收缩或干涸 重复性差、回收率低 ?