蛋白质的化学修饰和分子生物学改造.ppt

第三章蛋白质结构改造 主要内容 第一节 蛋白质分子设计 第二节 蛋白质的化学修饰 第三节 蛋白质的分子生物学改造 1 什么是蛋白质的化学修饰？ 通过各种方法使蛋白质分子的结构发生某些改变，从而改变蛋白质的某些特性和功能的技术过程称为蛋白质的化学修饰。 在体外将蛋白质分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变蛋白质的结构和性质。 蛋白质修饰后的性质变化:医药领域,工业酶领域 热稳定性：热稳定性可能获得较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除蛋白质药物的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于蛋白质药物分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。 2 蛋白质化学修饰的基本要求和条件 对蛋白质分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。 （1）蛋白质的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）蛋白质/酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。 蛋白质分子修饰的条件 修饰反应尽可能在蛋白质/酶稳定条件下进行，并尽量不破坏蛋白质/酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度 pH决定了蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 （3）反应体系中蛋白质与修饰剂的比例 3 蛋白质的化学修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰(共价/非共价) 蛋白质侧链基团的化学修饰 肽链有限水解修饰 (1) 蛋白质/酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。 金属离子置换修饰的过程 a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 (2) 蛋白质的大分子修饰 使用能与蛋白质非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在蛋白质分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护蛋白质的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于蛋白质分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 大分子修饰(共价)的过程 修饰剂的选择：采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、