逆转录聚合酶链反应中的细节问题-lhz.pptVIP

逆转录聚合酶链反应中的细节问题;RT-PCR原理;实验器具与材料 试剂 标本收集与保存 RNA抽提 逆转录反应(RT) 聚合酶链反应（PCR) ;一、实验器具、材料;1、DEPC水 500ml。 2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放4℃保存3、异丙醇4、氯仿5、电泳缓冲液(TAE/TBE)7、琼脂糖8、Taq酶（含MgCl2 Buffer）,-20℃ 9、dNTP ,-20℃ 10、随机引物,-20℃ 11、M-MLV逆转录酶 (Buffer) ,-20℃ 12、RNasin ,-20℃ 13、Trizol 100ml/1瓶 ,-4℃ 14、Marker, -20℃ 15、引物,-20℃ ;三、标本收集与保存 ;四、RNA抽提 ;2、了解RNA抽提的步骤原理，知道哪些是需要注意RNA酶污染的关键步骤，做到胆大心细。举例如下：;7)移去上清，加至少1 ml 的 75% 乙醇洗涤RNA 沉淀 ( 用 涡旋)，（此时RNA可至于75% 乙醇中存于 4 ℃至少一周或存于-20 ℃至少一年） 8)然后于 7,500 g ， 4 ℃ 离心 5 min（如 RNA沉淀积于管壁一侧和倾向于漂浮，于12,000 g沉淀） 9)移去上层的乙醇洗液，将RNA沉淀置空气中短时干燥.（ 注意不要让RNA沉淀完全干燥，因为这样将极大的降低其可溶性。但对于用于RT-PCR的样本而言，应尽量让RNA样本中的乙醇挥发，这对5-20微升的小体积样本尤其重要） 10)用30-50mlRNase-free的水溶解RNA几分钟，可用吸头吹几下（如还不溶于55-60 ℃孵育 10-15 分钟） 11)浓度质量检测;3、RNA质量检测;五、逆转录反应 ;First-Strand Synthesis of cDNA举例;;六、聚合酶链反应（PCR) ;PCR引物设计原理;PCR引物选择与设计; 用Primer Premier 5.0进行引物设计举例 ;;2、用Primer Premier 5.0进行引物设计;;;;;;四种重要指标：发夹结构(Hairpin)、二聚体(Dimer)、错误引发情况(False Priming) 、上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer) ;;;;Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3‘ Anti-sense:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 3;;;;;;;5、Blast进行同源性比较，确认引物的特异性后，联系公司，合成引物;PCR举例;注意：此PCR反应条件中缺预变性（94℃，5min)和最后的产物延伸（72 ℃，10min);;DNA琼脂糖凝胶电泳 ;实验步骤 ⑴ 配胶（1﹪琼脂糖凝胶）0.3 g 琼脂糖加入30 ml 0.5×TBE中，摇匀；在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到60℃，加入3μl的EB，并摇匀. ⑵ 制胶：把梳子插入制胶槽相应位置，将融解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，垂直向上拔出梳子，将凝胶连同胶槽置入电泳槽中，加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 (3) 点样：用移液抢吸取PCR产物5μl于塑料纸上，再加入1μl 的6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 (4) 电泳：（由负极向正极电泳）打开电源开关，调节至合适电压(一般电场强度不要超过5V／cm )；可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约15min-30min。 (5)观察：关掉电源，将凝胶小心的从电泳槽中取出，置于紫外透射检测仪上观察，拍照，并分析。;PCR反应条件的优化;（五）引物 引物浓度一般为0.1～ 0.5?mol/L （六）反应温度和循环次数 变性温度和时间 95℃/30 ～60s 退火温度和时间 45～55℃/30 ～60s 延伸温度和时间 72℃ 60s 循环次数 25～30 不超过35 ;PCR反应中可能出现的问题： 假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非特异扩增带 ;阴性结果应采取的措施 用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增 增加TaqDNA聚合酶的浓度 增加模板量 纯化模板 增加扩增循环次数 适当降低退火温度 增加镁离子浓度; ;谢谢！;