第六章酶的固定化.ppt

六 需注意的几个方面问题 （一）酶活性的测定方法 （二）制备过程中保持酶活性稳定的方法 （三）固定化酶的保存方法 （一）酶活性的测定方法 1 测定酶的固定化量 固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液） 中残存的酶含量。 2 测定颗粒直径 固定化酶的粒径越小，酶活性越高。固定化酶颗粒直径 大小影响酶活性。 3 测定酶反应最适pH值 酶固定化后反应的最适pH较原来的酶有所变化。 4 检查酶是否脱落 测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经 过适当保温检查是否还继续进行反应，如果溶液中出现酶 反应，说明酶脱落。 （二）制备过程中保持酶活性稳定的方法 1 包埋法、聚丙烯酰胺凝胶法或微型胶囊法时，固定化 反应时，预先用与酶有特异亲和力的底物等，保护酶 的活性中心，而后再进行固定化反应。 2 以酶的前体状态进行固定化，然后经过活化制备固定 化酶。 3 防止酶在催化反应中活性下降 下降原因 （1）酶的变性 （2）吸附了酶的抑制物质。 （3）被微生物污染 （4）酶脱落 （5）载体崩溃或变形分解 （6）操作失误 （三）固定化酶的保存方法 使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。 1 真空冷冻干燥保存（长期保存） 2 低温保存 3 多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体 更适于长期保存。 4 无机质载体中，以重氮结合法制备的固定化酶具 有较好的保存性。 七.固定化对酶活性及酶反应系统的影响 固定化对酶活性及酶反应系统所产生的影响十分复杂，常因酶的种类、反应系统的组成、特别是固定化方法以及固定载体而显著不同。在大多数情况下，固定化酶的活力低于相同的游离酶，但也有些固定化不引起酶活力下降，有时反应速度甚至还可能升高。 固定化对酶活性及酶反应系统的影响因素： 1 构象改变、立体屏蔽以及微扰 2 分配效应和扩散限制 1) 构象改变、立体屏蔽以及微扰 这些效应能直接影响酶的催化活性，它们的产生或者和固定化过程有关，或者和载体的性质有关，或者二者兼有之。 构象改变 是指固定化过程中酶和载体的相互作用引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性下降的一种效应。 该效应比较难于定量描写，也比较难于预测，但通常多出现于吸附法和共价偶联法。 立体屏蔽 是由于载体的孔隙太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。 这种效应也难于定量描写，多见于包埋，吸附法或共价偶联法。 微扰 是由于载体的亲水、疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应能力的一种效应。 这种效应更难于定量描写和预见，但是通过改变载体与介质的性质可作出判断与调节。 2).分配效应和扩散限制 这两种效应和微环境密切相关。所谓微环境，即是和固定化酶紧邻的微观局部环境，它和宏观体系不同，是引入了固定化载体以后产生的新概念。 分配效应 是由于固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。 扩散限制效应 是指底物、产物以及其它效应物的迁移 和运转速度受到限制的一种效应。 乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶 八、固定化酶的应用 世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60％左右。 泵 储 罐 反应产物 离心机 消旋反应器 固定化酶柱子 晶体 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 高果糖浆 也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。 高果糖浆的生产 世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞