改良CTAB法提取柚总DNA及叶片保存方法的研究.pdfVIP

第33卷 福建热作科技 、7l0l_33 NO．1 第1期 FujJan Science Technology of Tropical Crops 2O08 改良CTAB法提取柚总DNA及叶片保存方法的研究 潘一山 朱 呖 黄秋金 (1、漳州师范学院生物科学与技术系 漳州 363000 2、宁德市周宁县李墩镇政府党政办 宁德 355402) 摘要：采用改良的CTAB方法提取龙柚新鲜叶片的总DNA，在提取过程中，采用不同的处理液进行预处理，提得的DNA产 量高，纯度好，降解少，可用于PCR扩增，能满足相关的分子生物学研究要求。同时，尝试用饱和NaCI-CTAB保存液来保 存新鲜叶片，并对分别保存7天、14天、21天、28天的叶片进行总DNA提取，实验结果表明：保存7天的叶片总DNA提 取效果最佳。 关键词：柚 DNA提取 CTAB法 保存 中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：lOO -2327一 (2008)Ol—0OOl—03 柚Citrus maxima(burm．)merr．，芸香科 (Rutaceae) 1．2．1常规的CTAB法 柑桔属(citrus Linn．)，为热带地区常绿果树，是一类 剪取龙柚嫩叶0．2g，置研钵中，加少量石英砂及1 mI 重要的经济作物。中国是柚类的原产地，历史悠久，品 65℃预热的3xCTAB裂解液L4J，迅速研磨，再加1 ml 种资源丰富，是柚类遗传多样性分布中心之一。据统计， 裂解液，分装于 2只 1．5ml离心管中，65℃水浴裂解 我国现有的柚类品种有120个以上，大致分为沙田柚、 60min。10000 rpm离心10rain，取上清，加入等体积的 文旦柚和杂种柚3个品种群；同时具有极早熟、早熟、 酚．氯仿．异戊醇(25：24：1)，缓慢混合至上清呈乳状。 中熟和晚熟柚类资源结构。张太平等对柚的遗传多样性 lO000rpm离心10rain，取上清，置干净离心管中，加 研究表明，四川和广东为我国柚类遗传多样性的两大中 2倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混合，可见絮状 心，另外福建、广西、浙江、湖南为柚类遗传多样性的 沉淀。lO000rpm离心2min，弃上清，沉淀用75％乙 主要地区【l】a 醇洗2次，无水乙醇洗1次，自然风干后将其溶于2001ai 从分子水平上对柚的基因资源及遗传基础进行研究 高盐TE溶液中，置．2O℃冰箱保存备用。 是柚类种质资源的开发利用的一个重要方面【2J，而获取 1．2．2 改良CTAB法 高质量的总DNA是开展分子生物学研究的基础。由于 在常规CTAB法基础上，对提取方法进行改良，具 柚含有大量次生代谢物质，给 DNA的提取带来一定的 体如下： 难度。笔者就柚 DNA提取技术和新鲜叶片保存方法进 方法l：取龙柚嫩叶O．2g，置研钵中，加少量石英 行探索，旨在建立一种最适合柚的总DNA的提取方法， 砂及2ml溶液I，迅速研磨，分装于2个1．5ml的离 以及用保存液保存叶片的最佳方法和时间，使获得的 心管中。5000 rpm离心5rain，弃上清，沉淀再加1ml DNA可用于PCR扩增，能满足相关的分子研究要求。 溶液I，混匀，5000rpm离心5rain，弃上清，得沉淀。 1材料与方法 方法2：同方法1，预处理用溶液II处理1次，再 1．1试验材料 用溶液Ⅲ处理1次。 供试龙柚叶片采自漳州龙柚基地。 方法3：同方法1，预处理2次均用溶液Ⅳ。 溶液I：100 mmol／LEDTA