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胰岛素致低血糖对糖尿病大鼠脑组织NGF mRNA表达影响 　　[摘要] 目的 观察胰岛素致低血糖对糖尿病大鼠脑组织NGFmRNA表达变化的影响作用。 方法 48只Wistar大鼠按随机数字表法分为对照组（16只）、糖尿病模型组（32只），采用高脂高糖饮食+腹腔注射链脲佐菌素方法制备2型糖尿病大鼠模型，糖尿病模型组随机分为糖尿病非干预组（16只）和胰岛素低血糖组（16只）。胰岛素低血糖组大鼠予胰岛素皮下注射，每日1次，3组大鼠分别于第3、6、9、12天取4只大鼠的脑组织用RT-PCR法检测NGFmRNA。 结果 与对照组比较，糖尿病非干预组和胰岛素低血糖组大鼠脑组织NGF mRNA表达均不同程度下降，胰岛素低血糖组降低最为显著（P 　　1.2 分组及糖尿病造模 48只健康雄性Wistar大鼠室温25℃左右适应性饲养7 d，按随机数字表法分为糖尿病模型组（32只）、正常对照组（16只），模型组又随机分为胰岛素致低血糖组（16只）、糖尿病非干预组（16只）。参照文献[3-4]糖尿病大鼠模型制备方法：高脂高糖饲料（其中20.0%蔗糖，15.0%猪油，3.0%胆固醇，1.0%胆酸盐）喂养1个月，予腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的25 mg/kg链脲佐菌素，注射前禁食12 h，3 d后取尾静脉血测得随机血糖16.7 mmol/L示糖尿病模型制备成功。对照组大鼠腹腔仅注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，普通饲料常规饲养 1.3 胰岛素注射 糖尿病模型制备成功后第4天开始皮下注射胰岛素，胰岛素致低血糖组大鼠术前禁食12 h，予普通胰岛素注射液0.4 U/kg皮下注射，1次/d，共12 d。低血糖反应标准[5]：肢体抽搐，反应明显迟钝甚至昏迷，血糖≤2.8 mmol/L，20 min后灌胃10%葡萄糖水1 mL，低血糖反应缓解或消除。对照组及糖尿病非干预组大鼠皮下注射同等剂量生理盐水。三组大鼠分别于开始胰岛素注射后第3、6、9、12天各取4例的脑组织，以低血糖反应20 min左右取脑为宜，取脑大鼠不予灌胃葡萄糖水 1.4 RT-PCR法NGF mRNA检测 根据RT-PCR试剂盒说明以Trizol法提取大鼠脑组织总RNA。RT-PCR检测法参考文献[6]方法及试剂盒说明：逆转录为cDNA，94℃预变性5 min、94℃变性55 s、57℃退火45 s、72℃延伸50 s，共35个循环，以72℃终末延伸8 min；NGF上游引物序列为5′-GAT？鄄CGGCGTACAGGCAGAAC-3′，下游引物序列5′-GGCT？鄄CGCCACTTGGTCTCGA-3′；β-actin上游引物序列为5′-GGTGAAGGTGGGTGGCAA-3′，下游引物序列5′-TTCCCATTCTCAGCCTTAAC-3′ 1.5 统计学方法 采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用q检验。以P 0.05）。见表1 2.2 三组大鼠脑组织RT-PCR法NGFmRNA检测情况 与对照组比较，糖尿病非干预组和胰岛素致低血糖组大鼠脑组织NGF mRNA表达均明显下降（P 0.05）。见表2 3 讨论 DPN是2型糖尿病患者发病率很高的并发症，十分不利于糖尿病患者身心健康，尽管DPN的发病机制目前仍然未能完全阐明，但已有研究证实DPN的发病与NGF及其受体的改变与缺失密切相关[2]。NGF是神经营养因子家族中的主要成员之一，又称神经诱向因子，是一种从生物体组织中提取而来的生物活性分子，具有维持神经细胞生长发育及繁殖的作用，与神经细胞的生长、存活密切相关，对维持神经系统的发育及正常神经功能表达不可替代的作用[6]。NGF与特异性受体TrkA相结合发挥出提升神经细胞存活率及促进神经突触生长两方面生物活性，促进神经元修复并减少神经细胞凋亡，对神经系统的生长发育和神经轴突的再生修复均担负着举足轻重的作用[7]。高岭等[8]给予缺血缺氧性脑病新生儿出生6 h内常规治疗加NGF肌注，每日1次，连续14 d，用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测到患儿血清酸性钙离子结合蛋白S-100和髓鞘碱性蛋白MBP均明显下降，神经行为功能评分提高，而检测血清S-100和MBP水平是临床上常用判断脑损伤程度的有效指标，水平越升高表示脑损伤越严重，反之亦然。DPN的主要病理改变是神经纤维轴突变性、髓鞘皱缩或脱髓鞘、髓鞘再生致郎飞结节间长度改变，NGF及其受体的异常改变对DPN的病程演变起着重要的推动作用，无论是NGF合成障碍，逆向轴浆运输能力降低，仰或受体TrkA的表达异常，均可明显影响到受损神经的修复、再生[9]。糖尿病患者血糖波动次数越多幅