07-微生物直接计数和大小测定.ppt

微生物学实验 微生物计数和大小测定 一、实验目的 1、了解显微镜计数的原理； 2、学习微生物血球计数板直接计数法，测定酵母菌细胞数； 3、掌握用显微镜测微尺测量微生物大小的基本方法。 二、原理 1、血球计数板计数法： 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故称为总菌计数法。 计数室 （1mm x 0.1mm2) 容积10-4ml 将适当稀释过的菌悬液，加一滴在计数板上，盖上盖玻片，在显微镜下观察每小格内的细胞数，按下述方法计算出每毫升培养液中微生物的总数。 计数时，通常数五个中方格的总菌数（A），然后求得每个中方格的平均值，再乘上25（25个中方格）或16（16个中方格），就得出大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数，乘上稀释倍数（B），即原液中的总菌数。 总菌数（个/ml）=A/5×25（或16）×10000×B。 2、显微镜测微技术： 微生物的大小通常用测微计来测量，测微计分别有接目镜测微尺和镜台测微尺两部分。 接目镜测微尺是一块圆形玻片，在中央有一带刻度的尺，等份成50或100小格，每一格的大小是相对的，在同一接目镜下，随不同放大率的物镜而改变其大小。 镜台测微尺为一块载玻片，上胶有一圆形玻片，其中央部分有精确的刻度尺，刻度尺的长度是已知的，长度为1mm，等分为100小格，每小格间的距离即为0.01mm。 三、实验材料、器材 1、菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌； 2、染料：0.1%吕氏美蓝、石炭酸复红； 3、器材：显微镜、血球计数板、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片等。 四、方法及步骤 1、血球计数： ⑴灭活：取菌悬液一管（10ml）摇匀，加入1%的甲醛，将酵母菌灭活，充分振荡，使菌体分散成单体。 ⑵稀释：将菌液适当稀释（菌液如不浓可不必稀释），要求每小格内约3—5个菌体为宜。 ⑶染色：加0.1%的吕氏美蓝酒精溶液0.5ml，摇匀，使菌体着色。 ⑷取清洁干燥的血球计数器，在计数室上加盖盖玻片。 ⑸用滴管取稀释后的菌悬液，滴一滴于盖玻片边缘，使菌液自行渗入（不能有气泡产生），多余的菌液用吸水纸吸干，置于显微镜下计数。 ⑹计数时，数计数室四角及正中共五个中格的菌数（共80小格），每个样品计数需要重复两次，若数据相差太大，则要重复计数。 各中格中菌数 A B 二室 菌数/ml 1 2 3 4 5 平均值 第一室 第二室 ⑺计数完毕后，将计数器在水龙头下冲洗（绝不能用硬物洗刷），洗完后晾干或用吹风机吹干，镜检有无残留的菌体和其他沉积物，若不干净则必须重复洗涤至干净为止。 2、测微技术： ⑴接目镜测微尺的校正： 接目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央刻有刻度尺，等份成50或100小格。 镜台测微尺为一块载玻片，在上面胶有一块圆玻片，其中央有精确的刻度尺，长度为1mm，等分为100小格，每小格为10μm。 接目镜测微尺装入接目镜内隔板（光栏）上，刻度向下，并把镜台测微尺置于载物台上。 先用低倍镜校对，调节至能清晰地看到镜台测微尺为止。移动镜台测微尺和旋转目镜测微尺，使两者的刻度平行，并使目镜测微尺的“0”与镜台测微尺的一条线重合，然后找出两个尺的另一条线重合线之间两种测微尺上的格数 ? 按照下列公式即可求出在低倍镜下目镜测微尺每格的长度： 目镜测微尺每格长度（微米）=两条重合线间镜台测微尺格数×10 两条重合线间目镜测微尺格数 如：目测为30小格等于台测为20小格，已知台测每格为10微米，那么相应的在目镜测微尺上每格长度为（20×10）÷30=6.6（微米）。 用同样方法校正并求出在高倍镜上目镜测微尺每格的长度。 接物镜 接物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数 目镜测微尺每格代表的长度/μm 低倍镜 高倍镜 油镜 （2） 菌体大小的测定： 接目镜测微尺校正好后，将镜台测微尺从载物台上取下来，换上待测标本。 在