人外周血树突状细胞体外稳定、高效培养的新方法.pdfVIP

中国肿瘤生物治疗杂志 Chinese Journal of Cancer Biotherapy [文章编号] 1007-385X(2007)06-0575-03 ·短篇论著· 人外周血树突状细胞体外稳定、高效培养的新方法 Culture of dendritic cells from human peripheral blood in vitro：a stable and highly effective method 朱学军 ，李晓惠，夏 雯，张文曦，陈健一(江苏省中医院血液科，南京210029) [摘 要] 目的：建立稳定、高效的人外周血树突状细胞(dendritic cells，DC)体外培养的新方法。方法：离心获取人外周 血白膜层细胞，裂解去除红细胞后获得全部白细胞，贴壁培养1 h获得单核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)1 000 U／ml+重组人白细胞介素--4(rhlL-4)500 U／ml，体外培养7 d获得DC，以流式细胞术分析表型，体外混合 淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能。结果：从100 ml全血分离获得具有较好活力的贴壁单核细胞仅需2 h；部分肿瘤患者 应用传统分离方法不能获得单个核细胞，用新方法仍能从患者外周血稳定地获得足够数量的单核细胞。新方法培养生成DC 的数量为传统方法培养生成DC数量的1．8～2．6倍；其中40％～85％为CD1a ，表达高水平的HLA-DR、CD80、CD86，体外可 以强烈刺激同种T细胞增殖。结论：建立了更为稳定的、得率更高的DC体外扩增培养的新方法。 [关键词] 树突状细胞；细胞因子；肿瘤；免疫治疗 [中图分类号] R73．35 [文献标志码] A 在过去的十余年中，已经建立了从人外周血、脾 Fastblood 1 20 ml，拧紧管盖后轻缓颠倒混匀5次，静 脏、骨髓体外培养获得大量DC的多种方法¨ 。其 置3 min，再加入红细胞裂解液Fastblood 2 20 ml，立 中被最为广泛采用的方法是由Sallusto等 建立， 即颠倒混匀5次，200×g离心5 min，倒去上清后留 但此方法培养DC的操作烦琐，影响因素较多，不同 下底部沉淀，倒人生理盐水50 Tnl，拧紧管盖后颠倒 批次培养差异较大，故难以对DC实施质控，影响对 混匀数次，使底部沉淀全部散开，200×g离心5 临床疗效的判定，大大降低了DC临床应用的可行 min，倒去上清，再重复洗细胞2次，即获得纯化的白 性。因此，需要建立操作更为简单、产量和纯度更为 细胞。 稳定的DC培养方法。本研究采用外周血白细胞直 1．3 树突状细胞培养 接贴壁获得单核细胞，加人细胞因子培养，获得DC 上述分离获得的白细胞，用培养液悬浮细胞成 的产量是传统方法的1．8～2．6倍，建立了更为稳 5×10。／ml，每瓶20 Tnl，加人250 ml培养瓶(Nunc公 定、得率更高的体外扩增培养DC的新方法，此方法 司)中，37 oC、5％CO：孵箱培养1 h后，吸出培养上 的建立将有利于DC免疫治疗肿瘤的顺利开展。 清，加人预热的培养液轻轻洗培养瓶去除非贴壁细 胞，即获得贴壁的单核细胞。每瓶加人Cellgro DC 1 材料与方法 培养液30 ml、GM—CSF 1 000 U／ml，hlL-4 500 U／ml， 1．1 主要试剂 培养72 h后，补加30 ml培养液及细胞因子，培养至 rhGM—CSF购自厦门特宝公司；rhlL-4购自德国 第7天收集悬浮细胞即为DC，命名为白细胞来源 Cellgenix公司；红细胞裂解液Fastblood购自上海飞 DC(WDC)。 捷公司；丝裂霉素c、淋巴细胞分离液(Histopaque，