磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展.pdfVIP

第 37卷 分析化学 ( FENX IHUAXUE) 评述与进展 第 9期 2009年 9月 Ch inese Journal ofAnalytical Chemistry 1382~ 1389 柏兆方 王红霞* (国家生物医学分析中心, 北京 100850) 蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰, 在 胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、 蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研 究的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低, 难以用质谱直接检测。为了解决这个问题, 改善质谱对磷酸 肽的信号响应, 需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较 为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展, 包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和 富集法、化学修饰法、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法。 磷酸化蛋白质组, 分离富集方法, 评述 1 磷酸化是蛋白质翻译后修饰最为重要的形式。据统计, 哺乳动物 胞内的蛋白质有 1/3 以上可以 [ 1] 被磷酸化。真核生物 胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸 。其中, 磷酸化丝 氨酸最多, 磷酸化苏氨酸次之, 而磷酸化酪氨酸最少, 三者的比例是 1800B200B1。最新实验鉴定到三者 在真核 胞的百分比为 86. 4% 、11. 8%和 1. 8% [2] 。磷酸化蛋白在 胞信号转导、 胞的分化、增值、周 [ 3] 期调控、新陈代谢、转录和翻译、蛋白降解和 胞生存等 方面发挥着重要的作用。 磷酸化蛋白在 胞生命活动中的重要作用, 使其成为蛋白质组学研究的热点。但是磷酸化蛋白自 身的一些特点, 使得磷酸化蛋白质分析仍是一件很具挑战性的工作。首先, 磷酸化蛋白质含量很低, 在 特定刺激下仅有少部分蛋白发生磷酸化; 其次, 磷酸化的可变性, 使得不同条件下蛋白存在不同的磷酸 化形式; 再次, 现有的分析方法缺乏对磷酸化位点的动态分析, 使得部分位点难以鉴定。最后, 磷酸酶的 存在使得在样品制备过程产生脱磷酸化现象。因此对磷酸化蛋白或者磷酸化肽段进行富集, 提高磷酸 肽的相对含量, 成为磷酸化蛋白组学研究中的重要内容。 32 传统分析蛋白质磷酸化的方法是用放射性同位素 P标记到磷酸化的蛋白质上, 带有放射信号的蛋 白质可以通过蛋白质的分离, 如二维凝胶或HPLC 分离及 Edm an 测序等方法, 鉴定磷酸化氨基酸类型 [ 4, 5] 及位点 。这种方法除了具有放射性实验的缺点以外, 实验比较耗时并且不能进行高通量的磷酸化 蛋白组学分析。近年来, 一些富集方法不断改进及涌现, 如抗体法、固相金属离子亲和色谱 ( Immobi2 lizedmetal ion affinity chromatography, IMAC)、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱 (Metal o ide/hydro ide affinity chromatography, MOAC)、离子交换和等电聚焦、B2消除2M ichael加成反应等。目前各种富集方法 与质谱(M ass spectrometry, MS) 技术的结合已成为研究蛋白质磷酸化的主要工具, 逐渐取代了传统的 磷酸化蛋白质分析方法。本文综述了近年来用于分离富集磷酸化蛋白和肽段的各种方法。 2 2. 1 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀, 从复 杂混合物中免疫沉淀目标蛋白质。已经有商品化的