第八章 电泳法分析.pptVIP

（一）原理：等电聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH值梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH值位置上。 （二）优点：分辨率高，等电聚焦区带窄，稳定，精确度高，浓度低样品液可分离，浓缩作用。 六、等电聚焦电泳法 以A，B两种蛋白质为例，作出它们的净电荷曲线图，横轴代表环境中的pH值，纵轴代表蛋白質的净电荷，在 pH 6.5时，A带有两个正电荷，B带有一个负电荷。使A与B的净电荷为0的pH值分別为pH9和pH5，这就是它们的「等电点」。 （三）pH梯度形成 1 人工pH值梯度：用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度，不稳定，离子运动影响pH梯度。 2 天然pH值梯度：利用两性电解质在电场作用下自然形成pH梯度，电解硫酸钠稀溶液，阳极吸引负电荷聚焦硫酸，阴极吸引正电荷带负电。甲向阳极移动时接近硫酸失电荷到达等电点。具有很高缓冲能力。环境pH等于其等电点。用增加pI级数的方法形成阳极向阴极逐渐升高，稳定的pH梯度。 六、等电聚焦电泳法 （四）载体两性电解质条件 等电点处具有足够缓冲能力，不能被样品改变pH值梯度，化学组成稳定不影响等电点，具有足够高电导，均匀，分子量要小，便于与样品分离，化学样品组成不干扰测定。 （五）密度梯度等电点聚焦 密度梯度防止对流以保持pH值梯度，如蔗糖密度梯度，用溶解度高，黏度低，密度大的重溶和轻溶液以梯度混合形成。pH值梯度选择，蛋白质样品及分离容量。 （六）检测方法 蛋白质染色，已知pI值蛋白质标准电泳pI值位置，距离纵坐标，绘制pI梯度曲线，横坐标。 六、等电聚焦电泳法 （一）基本原理：高效毛细管电泳以弹性（熔融毛细管脆易折断，涂聚酰亚胺，石英毛细管富有弹性）石英毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据样品中个组分之间淌度（离子淌度，迁移率）和分配行为上的差异实现分离的分析方法。 电泳与电渗作用。 带电粒子迁移速度等于电泳电渗矢量和。 电渗速度一般大于电泳速度。 （二）毛细管分离模式 （三）优点 高效 快速 微量 多模式 自动 经济 洁净等。 七、高效毛细管电泳法 电泳现象： 带电离子在电场作用下的迁移，速度ν电泳电渗流现象： 玻璃表面存在硅羟基, pH3时, 形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反，ν电渗流 ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不 但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。 毛细管电泳类型 毛细管区带电泳（CZE） 胶束电动毛细管色谱（MEKC） 毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管等电聚焦电泳（CIEF） 毛细管电色谱（CEC） 七、高效毛细管电泳法 第八章 电泳法分析 生命科学学院制药工程 电泳技术原理 1 各种电泳技术 2 本章内容 第八章 电泳法分析 第一节 电泳技术原理 一、电泳 指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。 当溶液pH大于蛋白质pI， 蛋白质带负电，在电场中向正极移动。如果pH小于pI，带正电荷，向负极移动。蛋白质pH值在蛋白质等电点时，在电场中不向任何一极移动。 二、电泳技术分类 按支持介质不同分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳。 按凝胶形状分为水平平板电泳，圆盘柱状电泳，垂直平板电泳。 三、迁移率 定义：指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。 影响迁移率因素： 电荷：迁移率与颗粒表面电荷成正比。 颗粒大小和形状：迁移率与颗粒半径，介质黏度成反比。 电场强度：指单位长度支持物体上的电位降。电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。 常压电泳（100-500V） 高压电泳（500-10000V） 缓冲溶液pH值：决定颗粒带电情况 溶液离子强度：离子强度越高，迁移率越小 温度和黏度 第二节 各种电泳技术 纸电泳法 醋酸纤维素电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 高效毛细管电泳 等电聚焦电泳 （一）仪器装置（水平式电泳室） 一、纸电泳法 一、纸电泳法 （二） 操作方法： 1 电泳缓冲液：枸橼酸盐缓冲液 2 滤纸：选择质地均匀，吸附力小的滤纸 3 点样 湿法点样：将裁好的滤纸全部浸入电泳缓冲液湿润后取出，夹在干燥滤纸中吸干平放滤纸上