【基因工程药物作业】基因工程制备人白介11的技术流程.docVIP

《基因工程药物》课程作业 姓名：622 学号XXX 班级：生计11.3 基因工程制备人白介11的技术流程 一、从NCBI查找人白介11的基因序列（关键词：homo sapins , IL-11） 在NCBI主页的搜索框选择Nucleotide，输入关键词“homo sapins , IL-11”搜索核苷序列，可以看到前两记录分别为： Homo sapiens interleukin 11 (IL11), transcript variant 1, mRNA 2,381 bp linear mRNA Homo sapiens interleukin 11 (IL11), transcript variant 2, mRNA 2,208 bp linear mRNA 对应蛋白质的isoform也应该有两种，此次我们研究第一种。其序列如见附录一。 为得到cDNA，通过此序列的注释知道CDS为154..753，可以得到CDS，见附录二。 二、分析该基因的限制性内切酶位点 可以在分析该基因的限制性酶切位点。 对附录二中的序列进行分析，结果见附录三。 三、翻译该基因的蛋白质序列 用DNAMAN的translation或者/translate/对附录二的核苷酸序列进行翻译，结果见附录四。 四、分析蛋白质的分子量、等电点、糖基化、二硫鍵 1、用DNAMAN分析得： Protein Length=199 MW=21425.3 Predicted pI=11.20 2、利用分析得： http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/分析糖基化位点，结果见附录五。 /compute_pi/分析等电点得Theoretical pI/Mw: 10.64 / 21429.21，详细结果见附录六。 3、二硫键分析： 可以简单看到这个序列中有两个半胱氨酸（3，5），有可能形成二硫键，通过http://cassandra.dsi.unifi.it/分析的到结果如下 Position Residue Prediction Site 3 C D 5 C D 70 H 107 H 175 H 182 H M: Metal-bonded, D: disulfide-bonded 五、设计用pET-30a质粒在大肠杆菌中表达的引物 在目的基因的限制性内切酶位点时，我们发现目的基因没有EcR I, Xho I的酶切位点，所以可以使用EcR I, Xho I双酶切。这两个酶切位点在pET-30a中的位置如下图 设计PCR引物用于目的基因的扩增。 F：XXXF，5’- atga actgtgtttg ccgcctggtc c-3；’ R：XXXR，5’- ccgagtcttc agcagcagca a-3。 六、克隆基因，包括提取RNA、转cDNA、PCR扩增基因 1、提取RNA 从表达基因的组织中提取总RNA，或mRNA可以用RNA提取kit, Unizol, Trizol，本次实验选用Trizol，Trizol是总RNA提取试剂，在配制过程中加入了异硫氢酸胍，能够在组织匀浆过程中迅速灭活RNA酶，保持RNA的完整性。 提取的注意事项及步骤见附录七。 2、转cDNA 逆转录（ cDNA合成）步骤见附录八。 3、PCR扩增基因 RT-PCR 扩增目的基因，PCR反应体系详见附录九。 七、重组表达方法及表达条件优化 1、 对质粒进行双酶切，琼脂糖电泳检测质粒是否切开； 2、 纯化酶切后的PCR产物、质粒酚氯仿抽提, 或用kit纯化，酚/氯仿抽提法纯化DNA的步骤见附录十一； 3、 连接反应； 4、 转化宿主细胞； 5、 挑选菌落, 保种, PCR检测, 或测序； 6、 试表达，SDS检测表达情况； 整个技术路线如下图。 八、目的蛋白纯化方法（可溶和包涵体条件下的纯化方案） PET表达载体及其表达蛋白的纯化－金属螯合层析 A、可溶蛋白纯化步骤 金属(Ni2+)螯合琼脂糖凝胶6B FF装柱，2 ml体积； 用1×Binding Buffer平衡5-10个床体积，流速为1 ml/min； 加样品（ 1×Binding Buffer中， 0.45μm滤膜过滤）； 用1× Binding Buffer洗10倍体积； 用1×Wash Buffer洗柱6倍体积； 用分别含10、20、50、100、200 mM、1 M 咪唑的Elute 进行阶段洗脱，流速为2 ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS检测融合蛋白的分子量大小和纯度。 B、包